枳实和枳壳中活性化合物的富集检测与PAMPA快速筛选研究

发布时间：2018-06-05 01:31

本文选题：枳实 + 枳壳　；参考：《北京中医药大学》2017年硕士论文

【摘要】：枳实为芸香科植物酸橙Citrus aurantuL.及其栽培变种或甜橙Citrus sinensis Osbeck的干燥幼果。枳壳为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L及其栽培变种的干燥未成熟果实。枳实、枳壳中化学成分复杂多样,包括黄酮类,香豆素类、生物碱类、挥发类、柠檬苦素类。黄酮和香豆素为枳实和枳壳中的主要化学成分,具有抗氧化,抗过敏,抗炎,抗肿瘤,升压,强心,促进胃肠功能等作用。这些化合物溶解度及含量存在较大差异,且样品中其他共存杂质成分存在较大的干扰,为其样品的制备及准确定量带来极大的挑战。目前中药主要以某一个或者少数几个指标进行提取工艺筛选,但是中药是一个复杂的体系,其主要通过整体化合物的吸收发挥作用。因此本文首先采用固相萃取法对枳实和枳壳进行纯化和富集,分别得到二者的总的活性黄酮和香豆素化合物,对其化合物进行检测并建立不同品种枳实的指纹图谱研究。进一步采用PAMPA模型,从单体、中药整体体外吸收两个层面对枳实和枳壳进行提取工艺的快速筛选研究。以探索枳实与枳壳中有效成分的差异及肠吸收可能存在的机制,为枳实和枳壳质量评价方法提供重要依据,同时从生物利用度角度为枳实枳壳样品提取工艺的制备提供新方法。1.枳实枳壳中活性化合物的纯化富集与检测1.1枳实枳壳提取工艺的研究制订合理的提取工艺,是保证疗效的关键。为了确定有效成分最佳提取工艺,首先比较了提取方式回流与超声的提取效果,进一步以析因设计进行提取关键因素筛选,最后以关键因素甲醇浓度、溶剂倍数、提取时间为考察因素,采用采用正交设计法优化提取工艺。以枳壳中16个活性成分圣草次苷、芸香柚皮苷、橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、橙皮素、柚皮素、野漆树苷、川陈皮素、甜橙黄酮、5-去甲川陈皮素、橘皮素、7-OH香豆素、佛手柑内酯、橙皮油素、佛手柑素为指标。考虑含量高低悬殊,通过多指标综合评分法来对数据进行分析,评价不同提取工艺的提取效果。确定最佳提取工艺为:采用超声提取法,以125倍量75%甲醇作为提取溶剂,提取时间为30 min。1.2枳实枳壳固相萃取方案的优化枳实、枳壳中化合物种类较多,成分复杂,溶解度及含量存在较大差异。有些成分的含量比较低,容易受样品其他杂质成分的干扰,影响其准确定量。因此借助固相萃取法操作简便、集提取与分离于一体,且对微量成分具有较好的除杂与富集作用等优势,将其应用于枳实与枳壳的富集与纯化。以枳实和枳壳中20种不同结构类型的黄酮及香豆素为研究对象,从固相萃取小柱填料的筛选、穿透体积、淋洗溶剂及洗脱溶剂、洗脱体积对固相萃取条件进行优化,筛选出最佳纯化与富集方案为:固相萃取小柱以Strata-X填料,以2mL甲醇和5mL水平衡对小柱进行前处理,穿透体积为23mL,上样后以2 mL 30%的甲醇淋洗杂质,再以10 mL 100%的甲醇洗脱目标成分。结果显示通过固相萃取法,枳实枳壳提取物中总黄酮及香豆素化合物的含量提高了 35.55%—68.48%。提示固相萃取法具有很好的纯化富集作用。1.3枳实枳壳的含量测定研究固相萃取法优化方案确定后,我们将其应用于50批次不同品种的枳实与枳壳的含量测定及分类鉴别中。考虑待测成分化学类型多样性,采用HPLC多波长切换法进行检测,建立了枳实枳壳中20种黄酮和香豆素类成分快速检测及识别方法。线性范围、准确度、精密度、重复性、加样回收率、方法学考察结果显示,该方法稳定可靠,可以作为枳实枳壳中20种化合物的含量测定方法。结果表明在同品种不同生长阶段枳实和枳壳中各类化学成分,包括二氢黄酮、多甲氧基黄酮、香豆素的含量,枳实均高于枳壳。而在不同品种枳实中新橙皮苷、柚皮苷在分布和含量上均呈现较大的差异。借助多元统计分析软件,我们实现了对不同品种的枳实与同品种不同生长阶段的枳壳进行分类鉴别。总的来说,固相萃取法在枳实枳壳分类鉴别的前处理方面具有很好的应用价值。1.4不同品种指纹图谱研究采用HPLC-DAD方法建立18个批次酸橙枳实以及10个批次甜橙枳实的指纹图谱,通过对照品对照和紫外图谱指认了 17个色谱峰并对其进行含量测定。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)软件进行指纹图谱分析,进一步通过SIMCA-P 13.0软件对17个确认的成分含量进行最小二乘法判别分析,确定区分酸橙枳实与甜橙枳实的差异性标记物。结果表明新橙皮苷、柚皮苷、野漆树苷、橘皮素、橙皮素、5-去甲川陈皮素、橙皮油素,这些成分是造成不同品种枳实质量之间差异贡献较大的成分,对不同品种枳实的聚类分析具有显著性影响。该方法具有良好的精密度、稳定性和重复性,为枳实的质量控制和评价提供依据。2.枳实、枳壳活性化学成分的PAMPA快速筛选研究为探讨枳实枳壳中活性化合物的吸收情况及肠吸收可能存在的机制,为枳实枳壳的药物制备提供新方法,进行了以下研究。2.1 PAMPA模型的建立与质量评价采用大豆卵磷脂溶解在十二烷中作为膜材料在96孔过滤板上建立人工膜以模拟小肠上皮细胞膜,通过膜体积和浓度的优化,采用外观观察、荧光素钠检漏及四种阳性对照药普萘洛尔、卡马西平、华法林、呋塞米评价三种方式进行膜质量的考察方法。结果显示:采用浓度为5%的大豆卵磷脂,建立体积为10 μL的人工膜结构完整,质量可靠,可以作为PAMPA模型进行快速筛选研究。2.2 PAMPA模型上单体化合物的筛选研究对文献报道的枳实、枳壳中存在的43个不同结构类型的单体化学成分进行PAMPA筛选研究。借助HPLC-QqQ-MS/MS法的优势,实现了对43个成分在25 min内的快速分析,并计算各单体化合物在高、中、低三个浓度梯度下的有效渗透系数值。结果显示有效渗透系数值是化合物的固有性质,与浓度无关。不同结构类型的有效渗透系数值表明香豆素类成分,多甲氧基黄酮类,二氢黄酮苷元,黄酮苷元及柠檬苦素类成分的小肠吸收较好,而糖苷类成分吸收较差。2.3 PAMPA模型上中药整体提取物的筛选研究中药临床用药以整体发挥疗效,因此采用PAMPA模型建立中药整体的筛选研究具有重要意义。采用不同溶剂提取、固相萃取法进行纯化处理,得到枳实、枳壳的不同提取物组分,用于PAMPA模型的筛选研究。结果表明在中药整体提取物中共存成分对吸收有一定的影响,某些成分如橙皮苷、野漆树苷、地奥司明,表现出吸收促进的作用,可能与增加溶解度有关。中药整体提取物经过固相萃取法纯化后,吸收进一步增强。这建小结:本文主要进行了两个方面的工作:1.采用固相萃取法确立了枳实枳壳样品中酚性化学成分的纯化与富集方案,结合HPLC-DAD多波长切换法对不同品种枳实与同品种不同生长阶段枳实和枳壳进行分类鉴别的研究。结果显示不同品种枳实之间化学成分在质上存在较大差异,而同品种不同生长阶段之间枳实与枳壳主要存在量上的差异,随着生长时间的延长,酚性化学成分包括黄酮类,二氢黄酮类,多甲氧基黄酮类以及香豆素类,含量均呈现降低的趋势,临床用药枳实药效比枳壳迅猛,其功效的差异可能与含量的差异有关。此研究为枳实枳壳临床合理用药提供依据。2.采用PAMPA体外吸收模型对枳实枳壳中单体及整体提取物的快速筛选研究。单体化合物研究显示化合物的吸收渗透系数值是化合物的固有属性,与浓度无关,且吸收的强弱与化合物的脂溶性呈现一定的相关性。中药作为一个整体其内部成分之间存在相互作用,影响其吸收。通过固相萃取法纯化处理可以除去一些干扰吸收的组分,促进化合物的吸收。提示在中药提取制备中既要考虑内部化合物之间的配伍作用,又要对其进行提纯,对一些干扰组分进行处理,使中药在一个比较适当的纯度范围内发挥其最佳吸收,提高其生物利用度。此研究从生物利用度的角度为中药制备提供新方法。
[Abstract]:A method for extracting Fructus Aurantii Immaturus from Fructus Aurantii Immaturus and Fructus Aurantii may be selected from Fructus Aurantii Immaturus and Fructus Aurantii . A method for the determination of 20 kinds of flavonoids and coumarin from Fructus Aurantii Immaturus and Fructus Aurantii by means of multi - index comprehensive scoring method is used to determine the content of 20 kinds of flavone and coumarin in Fructus Aurantii Immaturus and Fructus Aurantii . A new method for the determination of immature bitter orange in immature bitter orange was carried out . The results showed that the method has good precision , stability and repeatability , and it can be used as a new method for the quality control and evaluation of immature bitter orange . In this paper , a new method for the determination of the chemical components of Fructus Aurantii Immaturus and Fructus Aurantii by solid - phase extraction is studied . The results show that the absorption and permeability coefficient of Fructus Aurantii Immaturus is different from that of Fructus Aurantii .
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R284.1

【参考文献】