HMGA2调节Atg12-Atg5的形成在铬诱导自噬中的机制研究

发布时间：2018-10-24 21:39

【摘要】：铬(Cr),作为一种银灰色金属,在自然界中存在二价、三价和六价三种价态。六价铬毒性最大,国际癌症研究机构1990年就将六价铬列为确认的I类致癌物。大量流行病学研究和动物实验研究表明,暴露在环境中的六价铬化合物与多种癌症和肿瘤的发病密切相关。研究表明,低剂量的六价铬可以诱导自噬,其机制是通过吞噬肿瘤细胞受损的细胞器和细胞质蛋白,并将其降解成细胞所需的营养物质再循环利用,维持肿瘤细胞活性,提高肿瘤细胞增殖率,促进肿瘤的发生。自噬可以诱发肿瘤,并为其提供一个低氧气和营养限制的条件,此过程需要自噬相关蛋白(ATG)协调参与。HMGA2在不同的生物学过程中具有关键意义。HMGA2在许多恶性肿瘤中过表达。课题组前期研究发现氯化镉(Cd Cl2)通过诱导ROS的形成引起了HMGA2表达上调,而HMGA2表达上调导致了MRC-5细胞周期和细胞增殖的变化。我们也发现了,氯化镉引起细胞增殖的浓度同样诱导了细胞发生自噬。现阶段没有文献报道HMGA2在自噬中的作用,且低剂量重铬酸钾诱导自噬的机制也在探索阶段。因此,本研究以重铬酸钾作为研究对象,探讨HMGA2在重铬酸钾所引起的自噬中的作用。目的:研究低浓度的重铬酸钾对自噬的影响,及HMGA2在重铬酸钾诱导自噬中的可能分子机制。方法:本研究以人肺腺癌细胞(A549细胞)和人胚肾细胞(HEK 293细胞)作为体外实验模型,以BALB/c小鼠作为体内实验模型。BALB/c小鼠经重铬酸钾处理后,利用蛋白质印迹法观察小鼠肺组织自噬相关蛋白、HMGA1和HMGA2蛋白的表达情况。利用透射电子显微镜检测重铬酸钾对小鼠肺组织自噬小体数量的影响。利用MTT法检测重铬酸钾对A549细胞的细胞增殖率的影响,及自噬干预剂3-MA预处理后染毒重铬酸钾的A549细胞的细胞增殖率的变化。利用吖啶橙染色和透射电子显微镜观察重铬酸钾对A549细胞自噬溶酶体和自噬小体数量的影响,利用蛋白质印迹法观察自噬相关蛋白表达的变化。运用si RNA干扰技术,检测HMGA2对重铬酸钾所引起的细胞自噬的影响。利用吖啶橙染色和透射电子显微镜观察HMGA2对重铬酸钾处理的A549细胞内自噬溶酶体和自噬小体数量的影响,利用蛋白质印迹法观察HMGA2对自噬相关蛋白表达量的影响,q PCR实验观察HMGA2对Atg5和Atg12基因的表达情况的影响。在HEK 293细胞转入pc DNA 3.1-HMGA2质粒,通过蛋白质印迹法观察HMGA2对自噬相关蛋白表达量的影响。结果:重铬酸钾处理的BALB/c小鼠肺组织自噬相关蛋白(LC3II、p62、Atg12-Atg5、Atg4、Atg5、Atg7、Atg12、Beclin 1)、HMGA1和HMGA2蛋白的表达量均升高(P0.05,P0.01)。透射电子显微镜观察的结果也显示染毒组小鼠肺组织自噬小体数量增加(P0.01),说明重铬酸钾诱导BALB/c小鼠肺组织自噬。低浓度重铬酸钾(0.1、0.2μM)作用A549细胞24小时后,吖啶橙染色和透射电子显微镜结果可见细胞内自噬溶酶体和自噬小体数量的显著增加(P0.01),自噬相关蛋白(LC3II、Atg12-Atg5、Atg4)、HMGA1和HMGA2的蛋白表达水平显著升高(P0.05,P0.01),p62蛋白表达水平下降。说明低浓度重铬酸钾诱导A549细胞自噬。在HMGA2 si RNA处理的A549细胞内发现,自噬溶酶体和自噬小体的数量减少、LC3II和Atg12-Atg5蛋白表达水平降低,p62蛋白降解抑制,但Atg5和Atg12蛋白水平无明显变化。说明HMGA2可能是通过Atg12-Atg5偶联蛋白调控重铬酸钾诱导的细胞自噬。为了证明我们的观点,利用q PCR实验,分析证实Atg5和Atg12基因的表达量并不随着HMGA2的变化而改变。在HEK 293细胞中,可以检测到随着HMGA2表达量的升高,LC3II和Atg12-Atg5蛋白表达水平升高,p62表达水平下降,Atg5和Atg12蛋白的表达水平无明显差异。上述结果表明,HMGA2是通过调节Atg12-Atg5偶联结合从而促进重铬酸钾诱导的细胞自噬。结论:HMGA2诱导Atg12-Atg5蛋白的偶联,是重铬酸钾诱导自噬的主要机制。
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【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R114

【参考文献】