β-arrestin2在肝纤维化中的作用及CP-25对其的影响

发布时间：2018-11-03 07:56

【摘要】：肝纤维化是由各种致病因子引起的以细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积、结缔组织异常增生为特点的肝脏结构和功能的异常病理变化。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)是ECM的主要来源,是肝纤维化形成的细胞学基础。β-arrestin2是arrestin家族成员之一,它是众所周知的G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)调节蛋白,参与受体的脱敏和内化。近年来研究发现,它还可以调节许多非GPCRs受体的信号转导,比如可与TGF-βIII型受体(type III TGF-βreceptor,TβRIII)相互作用参与胞内信号通路,影响细胞功能。课题组前期研究表明,体外使用β-arrestin2 si RNA转染HSC可抑制其增殖和胶原产生,但尚缺乏整体水平的研究。白芍总苷(total glucosides of paeony,TGP)是从芍药干燥根中提取的活性部位,其主要成分(40%)是芍药苷,为提高芍药苷的生物利用度,经过结构改造合成了芍药苷-6’-O-苯磺酸酯(paeoniflorin-6’-O-benzene sulfonate,CP-25)。课题组以往研究表明,TGP和芍药苷均具有减轻肝纤维化的作用,那么CP-25是否也能发挥抗肝纤维化作用?其是否通过调节β-arrestin2发挥作用呢?为此,本研究首先收集临床肝纤维化患者组织标本,检测不同程度肝纤维化患者肝脏中β-arrestin2和TβRIII的表达情况;使用β-arrestin2-/-小鼠建立四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl_4)诱导的肝纤维化模型,观察整体水平β-arrestin2基因敲除是否可缓解肝纤维化;同时,对CCl_4诱导的肝纤维化小鼠灌胃给予CP-25,观察CP-25是否具有抗肝纤维化作用;进一步体外研究选用人肝星状细胞株LX-2,转染β-arrestin2过表达质粒,探讨CP-25可能的作用机制。目的:收集临床肝纤维化患者肝脏标本,检测β-arrestin2和TβRIII的表达;分别用野生型(wide type,WT)C57BL/6J小鼠和β-arrestin2-/-小鼠诱导肝纤维化,观察肝纤维化形成情况;对CCl_4诱导的野生型肝纤维化小鼠灌胃给予CP-25,观察CP-25能否能减轻肝纤维化;体外使用β-arrestin2过表达质粒转染LX-2细胞,再给予CP-25,阐明其作用机制。方法:选取不同程度肝纤维化患者肝组织石蜡切片,通过免疫组化法检测β-arrestin2和TβRIII在肝脏中的表达和分布;用CCl_4将野生型C57BL/6J小鼠和β-arrestin2-/-小鼠诱导为肝纤维化,试剂盒检测血清转氨酶水平、肝匀浆氧化及抗氧化指标、羟脯氨酸含量,CCK-8法检测T、B淋巴细胞的增殖,流式细胞术检测淋巴细胞亚群的比例,Western blot法检测肝组织中β-arrestin2、Collagen I、TGF-β1、TβRIII的表达变化以及Smad2、Smad3、Akt信号通路的激活情况;CCl_4腹腔注射C57BL/6J小鼠建立肝纤维化模型,分为正常对照组、模型组、CP-25(25、50、100 mg/kg)组、TGP组(100 mg/kg)、秋水仙碱组(0.15 mg/kg),检测纤维化相关指标的变化;体外使用β-arrestin2过表达质粒转染LX-2细胞,给予CP-25,观察LX-2细胞β-arrestin2、Collagen I、TβRIII的表达变化以及Smad2、Smad3、Akt信号通路的激活情况。结果:1.β-arrestin2、TβRIII在不同程度肝纤维化患者肝脏中的表达免疫组织化学染色法检测肝内胆管结石和不同程度肝纤维化患者肝脏组织标本,结果显示,β-arrestin2在肝纤维化患者肝脏中的表达明显高于肝内胆管结石患者,随着肝纤维化程度的加重,β-arrestin2表达增加;而TβRIII在肝纤维化患者肝脏中的表达减少。2.β-arrestin2基因敲除对小鼠肝纤维化的影响用CCl_4诱导小鼠肝纤维化模型,相比于野生型小鼠,β-arrestin2-/-小鼠血清转氨酶水平降低;肝匀浆超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)活力增加,丙二醛(malonaldehyde,MDA)、羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量减少;CCK-8检测显示T、B淋巴细胞的增殖被抑制;流式细胞术结果显示脾脏CD4+CD62L+T细胞比例上升,CD4+CD69+T细胞比例下降,Th17/Treg比率下降;Western blot结果显示,相比于野生型小鼠,β-arrestin2-/-小鼠肝组织中β-arrestin2几乎不表达,Collagen I、TGF-β1表达下降,TβRIII的表达增加,p-Smad2、p-Smad3、p-Akt的表达均下降,而Smad2、Smad3、Akt的表达无明显变化。3.CP-25对CCl_4诱导的肝纤维化小鼠纤维化的影响与肝纤维化模型组相比,灌胃给予CP-25后,小鼠血清转氨酶水平降低;肝脏中SOD、GSH活力增加,MDA、Hyp含量减少;CCK-8检测显示T、B淋巴细胞的增殖被抑制;脾脏CD4+CD62L+T细胞比例上升,CD4+CD69+T细胞比例下降,Th17/Treg比率下降;Western blot结果显示,CP-25可降低肝组织Collagen I和β-arrestin2的表达。4.CP-25对β-arrestin2过表达的LX-2细胞中Collagen I、β-arrestin2和TβRIII表达的影响Western blot结果显示,TGF-β1刺激使LX-2细胞I型胶原表达增加,CP-2510-8~10-5 mol/L可抑制LX-2细胞中I型胶原的生成;向LX-2细胞中转染p EGFP-C2-arrestin2质粒,β-arrestin2、Collagen I的表达均增加,而TβRIII的表达降低,给予CP-25可降低β-arrestin2、Collagen I的表达,增加TβRIII的表达。5.CP-25对β-arrestin2过表达的LX-2细胞中Smad2、Smad3和Akt信号通路激活的影响Western blot结果显示,LX-2细胞中转染高表达b-arrestin2质粒后,p-Smad2、p-Smad3和p-Akt的表达均增加,而Smad2、Smad3和Akt的表达无明显变化;CP-25可抑制Smad2、Smad3和Akt信号的激活。结论:1.在不同程度肝纤维化患者的肝脏标本中,随着纤维化程度的加重,β-arrestin2表达增加,提示β-arrestin2可能与纤维化的发生发展有关。2.相比于野生型肝纤维化小鼠,β-arrestin2-/-小鼠肝纤维化程度明显减轻,脾脏CD4+CD62L+T细胞比例上升,CD4+CD69+T细胞比例下降,Th17/Treg比率下降;肝脏TβRIII表达增加,p-Smad2、p-Smad3、p-Akt的表达降低,提示β-arrestin2基因敲除可能通过调节T细胞亚群比例、抑制Smad2、Smad3和Akt信号通路的激活,减轻小鼠肝纤维化。3.CP-25灌胃给予肝纤维化小鼠可降低转氨酶水平,减少肝脏中羟脯氨酸含量和Collagen I、β-arrestin2水平,升高CD4+CD62L+T细胞比例,降低CD4+CD69+T细胞比例和Th17/Treg比率,提示CP-25可发挥抗肝纤维化作用。4.体外给予CP-25,可抑制过表达β-arrestin2的LX-2细胞中Collagen I表达的增加,及Smad2、Smad3、Akt信号的激活,促进TβRIII表达增加,提示CP-25可能通过抑制β-arrestin2的表达,增强了TβRIII对Smad2、Smad3、Akt信号通路的抑制作用,从而减轻肝纤维化。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

【参考文献】