山芝麻酸甲酯对PDGF-BB刺激的肝星状细胞ERK信号通路的影响

发布时间：2018-11-09 15:48

【摘要】：目的:细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)作为可以转移至细胞核并激活转录因子的蛋白激酶,是众多信号通路的“瓶颈”和汇集点。近年来发现抑制ERK信号通路,从而抑制HSCs活化与增殖,是目前治疗肝纤维化比较理想的选择。本实验通过检测山芝麻酸甲酯(methyl helicterate,MH)对ERK信号通路上游靶位Raf、ERK1/2的表达及其磷酸化水平的影响和对转录因子c-fos、c-jun、c-myc和Ets-1表达的影响,探讨其体外抗肝纤维化的分子机制。方法:HSC-T6、LX2和7702选为本实验采用的肝星状细胞,体外培养。用不同浓度MH作用于细胞,CCK-8试剂盒法检测MH对细胞的毒性作用;10 ng/m L PDGF-BB,50μM PD98059及MH作用于细胞后,CCK-8试剂盒法、LDH法、划痕实验、集落生成法、AO-EB染色和AnnexinⅤ-FITC/PI分别观察细胞增殖、LDH活力、迁移、集落形成、凋亡及细胞周期;RT-PCR法观察ERK1、ERK2、Raf、c-fos、c-jun、c-myc和Ets-1 m RNA的表达;Western bolt免疫印迹法观察细胞ERK1/2、p-ERK1/2和Raf、p-Raf的表达。免疫组化法观察细胞c-fos、c-jun、c-myc、Ets-1和I型胶原(Col-I)、Col-Ⅲ的表达。结果:(1)MH对PDGF诱导的细胞增殖、LDH活性、迁移、集落形成、凋亡及细胞周期的影响实验结果发现,外源性刺激因子PDGF-BB刺激的模型组与正常对照组比较,细胞在24 h处增殖明显,差异有统计学意义;12.5、25、50μg/m L的MH作用组与刺激组比较均能抑制细胞增殖,呈浓度依赖性(P0.05或P0.01)。与正常组比较,PDGF-BB刺激组细胞增殖明显增强、LDH活性明显减弱(P0.01),细胞迁移及集落生成分别加快、增多,细胞形态学、细胞凋亡率和细胞周期均无明显改变;经药物干预后,PD98059和MHL、MHM、MHH能明显抑制细胞增殖、迁移及集落的生成,提高LDH活性,此外,还引起细胞形态学发生变化,提高细胞的凋亡率,诱导细胞阻滞于G2期(P0.05或P0.01)。以上结果表明,MH能明显抑制肝星状细胞的增殖、迁移及集落的生成,并促进其凋亡。因而,证实了MH抗肝纤维化的调控机制与抑制肝星状细胞的增殖有关,为其靶向防御肝纤维化提供了实验依据和理论支持。(2)MH对PDGF诱导的细胞Col-I和Col-Ⅲ表达的影响免疫组化结果显示,与正常组比较,PDGF刺激组细胞Col-Ⅲ合成和分泌明显增多,Col-I含量升高。经药物干预后,PD98059和MHL、MHM、MHH能显著抑制Col-Ⅲ的合成和分泌,降低Col-I含量。结果提示,MH抗肝纤维化的发生发展与其抑制肝星状细胞胶原的合成与沉积密切相关。(3)MH对PDGF诱导的细胞信号通路上游靶位Raf以及ERK1/2的表达及其磷酸化水平的影响实时荧光定量PCR实验结果表明,PDGF可显著上调肝星状细胞Raf以及ERK1/2 m RNA的表达(P0.01)。Western Blot结果显示,PDGF刺激组细胞Raf、p-Raf以及ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达明显增(P0.01)。经药物干预后,PD98059与MH均能显著下调细胞Raf、ERK1/2 m RNA和Raf、p-Raf及ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表达(P0.05或P0.01)。可见,MH能显著抑制肝星状细胞Raf及ERK1/2的表达和磷酸化水平,降低上游靶位ERK的活性,对ERK信号通路有明显的抑制作用。(4)MH对PDGF诱导的细胞转录因子c-fos、c-jun、c-myc和Ets-1表达的影响实时荧光定量PCR实验结果显示,PDGF刺激组细胞c-fos、c-jun、c-myc及Ets-1 m RNA表达明显高于正常组(P0.01)。经药物干预后,PD98059与MH均能显著下调细胞c-fos、c-jun、c-myc及Ets-1 m RNA水(P0.05或P0.01)。免疫细胞化学染色结果,显示细胞质内c-fos、c-jun、c-myc及Ets-1阳性染色细胞增多浓染。经药物干预后,PD98059与MH细胞质内c-fos、c-jun、c-myc及Ets-1阳性染色细胞数减少淡染。这表明,MH能抑制细胞转录因子c-fos、c-jun、c-myc和Ets-1表达,其能抑制ERK活化,阻滞了ERK通路信号传导。结论:MH能抑制PDGF-BB诱导的细胞增殖,Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达,阻滞细胞在G2期,诱导细胞凋亡;MH可调控Raf及ERK1、ERK2 m RNA的水平,抑制Raf及ERK1/2及其磷酸化和c-fos、c-jun、c-myc和Ets-1表达。以上结果表明,MH能明显抑制肝星状细胞的活化,其机制可能与抑制ERK1/2信号通路有关。
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【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

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