基于激活Nrf2信号通路探研藁本内酯对叔丁基过氧化氢致氧化应激损伤下脐静脉内皮细胞保护作用

发布时间：2018-12-11 19:44

【摘要】：背景和目的动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是冠状动脉粥样硬化(coronary atherosclerosis,CAS)性心脏病重要的病理基础,许多研究发现氧化应激(oxidative stress,OS)是AS的重要病理基础。核因子E2相关因子(nuclear factor E2 related factor,Nrf2)是人体内抗OS的关键因子,其通过与抗氧化原件(antioxidant response element,ARE)的结合来启动下游的抗氧化基因:血红素加氧酶(heme oxygenase-1,HO-1)、醌氧化还原酶(NAD(P)H quinone oxidoreductase 1,NQO1)、超氧化物歧化酶 1(superoxide dismutase 1,SOD1)、超氧化物歧化酶 2(superoxide dismutase 2,SOD2)、过氧化氢酶(catalase,catalase)来对抗OS,因此寻找有效的Nrf2激活剂就自然成为治疗AS的新渠道之一。藁本内酯是导师顾宁教授创制"宁心痛颗粒"中臣药川芎的主要活性成分,具有抗炎、抗氧化、保护心肌细胞等药理作用。我们研究团队前期研究已经证实宁心痛颗粒具有抗粥样斑块的作用,但对其细胞和分子的多重机制的阐述尚不完全清楚,因此本研究选择以人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)为干预目标,以宁心痛颗粒中主要有效组分藁本内酯为研究对象,探寻其对内皮细胞损伤的关键机制"OS"的干预作用,探讨藁本内酯影响AS形成及发展的作用机制,是前期工作的进一步深入和延续。同时也为进一步深入研究宁心痛颗粒通过抑制HUVECs的OS损伤从而干预AS作用机制、及临床治疗AS与冠心病提供一定依据。研究方法体外培养HUVECs,使用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)法检测不同剂量下的藁本内酯对HUVECs细胞活力的影响;应用荧光素酶报告基因法检测不同剂量及不同孵育时间的藁本内酯对于ARE的激活效应。实施逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测不同剂量及不同孵育时间的藁本内酯作用于HUVECs后,其对Nrf2及其下游基因HO-1,NQO1,SOD1,SOD2和CAT的mRNA表达的影响;应用Western Blot法检测不同剂量及不同孵育时间的藁本内酯作用于HUVECs后,其对Nrf2及其下游基因HO-1,NQO1,SOD1,SOD2和CAT的蛋白表达的影响。根据上述结果,选择能够最充分激活Nrf2及其下游基因的藁本内酯的剂量和作用时间,应用MTT法检测藁本内酯能否挽救叔丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide,t-BHP)对HUVECs的损伤;应用2,7-二乙酰二氯荧光素(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)荧光法,观察藁本内酯是否能降低t-BHP所提高的HUVECs中的活性氧族(reactive oxygen species,ROS)含量。结果(1)MTT法结果显示预孵育(0-100μM)藁本内酯24h,对HUVECs的细胞活力没有明显的影响。(2)荧光素酶报告基因结果显示(1,10,50,100μM)剂量的藁本内酯孵育24h,可以诱导出高水平的ARE驱动的荧光素酶活性。其中100μM的效果最好,对比空白组大约有11.5倍的荧光强度的增加。(3)荧光素酶报告基因结果显示100μM藁本内酯孵育2,4,8,12,24h,可以诱导出高水平的ARE驱动的荧光活性。其中孵育24h的效果最好,对比空白组大约有11.9倍的荧光强度的增加。(4)使用1,10,50,100μM的藁本内酯预孵育HUVECs24h后,RT-PCR结果显示Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1、SOD2 和 CAT 的 mRNA 表达量在 1,10,50,100μM 四组中均增多,尤其是在1000μM中增加最多。(5)使用100μM的藁本内酯预孵育HUVECs 2,4,8,12,24h后,RT-PCR结果显示Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1、SOD2 和 CAT 的 mRNA 表达量在 2,4,8,12,24h 五组中均增多,尤其是在24h中增加最多。(6)使用1,10,50,100μM的藁本内酯预孵育HUVECs 24h后,Western Blot结果显示Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1、SOD2 和 CAT 的蛋白表达量在 1,10,50,100μM 四组中均增多,尤其是在100μM中增加最多。(7)使用100μM的藁本内酯预孵育HUVECs 2,4,8,12,24h后,Western Blot结果显示Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1、SOD2和CAT的蛋白表达量在2,4,8,12,24h五组中均增多,尤其是在24h中增加最多。(8)MTT法结果显示使用100μM藁本内酯预孵育HUVECs24h,可以有效挽救孵育250 μM t-BHP 6h导致的HUVEC s细胞活力的降低。(9)DCFH-DA荧光法结果显示单独使用250μM t-BHP孵育HUVECs 6h细胞内的ROS含量较正常组明显升高,而使用10OμM藁本内酯预孵育HUVECs 24h,可以有效降低孵育t-BHP导致的HUVECs中增加的ROS含量。结论藁本内酯是有效的Nrf2激活剂,以100μM孵育24h的激活效果最好。藁本内酯通过激活 Nrf2及其下游的 HO-1、NQO1、SOD1、SOD2 和 CAT,清除 ROS,保护 HUVECs,改善血管内皮功能,一定程度阻遏AS的进展。
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【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

【参考文献】