苦碟子注射液及其倍半萜内酯类成分对大鼠CYP450的抑制作用及肝微粒体代谢研究

发布时间：2019-03-09 14:47

【摘要】：缺血性心脑血管疾病一直是困扰临床医生的难题,近年来,中医药在治疗缺血导致的心脑血管损伤疾病方面具有较好的临床经验。苦碟子注射液(KDZI)是一种从菊科植物苦碟子全草提取有效活性物质而被制成的中成药,临床上主要治疗冠心病、脑血栓、心肌梗死等缺血性心脑血管疾病,常与其他药物联合使用,如注射用血栓通。由于绝大多数药物的代谢都需要肝脏中的药物代谢酶(CYP450)参与,同时药物可诱导或抑制CYP450的活性。近年来,药物联合使用后的相互作用导致的不良反应逐渐上升,从药物代谢酶的角度,进行药物相互作用的探索为诸多学者的研究重点。KDZI与其他药物合用后是否会产生不良反应,目前缺乏相关全面研究。由于药物对肝CYP450活性的影响研究对探讨药物间的相互作用有着重要意义,故本课题旨在从药物代谢酶的角度,采用"Cocktail"探针法结合超高效液相-质谱联用(UPLC-MS/MS)技术KDZI及2个主要倍半萜内酯类化合物(IZ、DIZ)对大鼠肝细胞色素P450酶活性的抑制作用。同时,在负离子模式(ESI-)下,应用超高效液相-线性离子阱-静电轨道阱质谱(UPLC-LTQ-Orbitrap MS)分析技术研究KDZI、IZ及DIZ的肝微粒体代谢情况,为其临床安全合用药物、安全性评估及毒理学研究等提供现代科学支持。以下为本课题主要研究内容及结果:1."Cocktail"探针法结合UPLC-MS/MS定量分析方法的建立参照《药理实验方法学》,制备大鼠肝微粒体,并运用BCA试剂盒法测定其蛋白含量。根据FDA指南推荐,选择非那西丁、甲苯磺丁脲、奥美拉唑、睾酮和氯唑沙宗分别作为CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A和CYP2E1的探针底物;5种探针底物的特异性代谢型产物分别为对乙酰氨基酚、4-羟基甲苯磺丁脲、5-羟基奥美拉唑、6β-羟基睾酮和6-羟基氯唑沙宗。本文采用"Cocktail"探针法结合UPLC-MS/MS,以多奈哌齐为内标,建立了同时测定5种探针底物代谢产物含量的方法。肝微粒体孵育样品处理采用2倍体积冰冷乙腈蛋白沉淀法;色谱柱:WatersACQUITYBEHC18(1.7纽m,2.1×100mm);流动相:甲醇/乙腈(v/v,1:1)-0.1%甲酸水系统;流速:0.4mL.min-1;柱温:40℃;梯度洗脱;正离子模式(ESI+)下,多反应离子监测(MRM)模式检测,并对所建立的分析方法进行系统的方法学考察。方法学考察的结果提示建立的方法专属性强,灵敏度高,可以用于KDZI、IZ及DIZ对5种大鼠肝细胞色素P450酶活性抑制作用的研究。2.苦碟子注射液及其倍半萜内酯类成分对大鼠肝细胞色素P450酶活性的抑制作用研究利用UPLC-MS/MS结合"Cocktail,"探针法,并对肝微粒体孵育系统条件进行优化,研究KDZI、IZ及DIZ,对大鼠肝微粒体中5种主要的药物代谢酶CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4和CYP2E1活性的抑制作用,并依据FDA指南推荐CYP450亚型的阳性抑制剂对优化的孵育体系进行验证。结果表明,建立的孵育体系符合指南要求,IZ对CYP2C19的IC50值是21.76 μmol·L-1,对其有微弱的抑制作用,对CYP3A4的IC50值是 145.1 μmol.L-1,对 CYP1A2 和 CYPP2C9 的 IC50 值大于 200 μmol.L1,对 CYP2E1无抑制作用。DIZ对CYPP2C9的IC50值是9.46 μmol·L-1,对CYP2C9有中等程度抑制作用,对 CYP1A2 和 CYP2C19 的 IC50 值大于10 μ0mol·L-1,对 CYP2E1、CYP3A4 无抑制作用。KDZI 对 CYP3A4 的 IC50 值是 9.18%,对 CYP2C9、CYP2C19 的 IC50 值大于8.00%,对CYP1A2的IC50值大于10.00%,对CYP2E1无抑制作用。3.苦碟子注射液及其倍半萜内酯类成分的肝微粒体代谢研究制备KDZI、IZ及DIZ的肝微粒体温孵样品,基于UPLC-LTQ-Orbitrap MS技术,分别对KDZI、IZ及DIZ的肝微粒体代谢进行了研究。结果显示,19个化合物被检测(包括2个原型化合物和17个代谢产物被筛选),其中鉴别了 2个原型化合物和16个代谢产物,代谢产物主要发生羟基化,加氢,脱氢的I相代谢反应。结果表明,KDZI、IZ及DIZ经肝微粒体代谢后主要发生包括羟基化、加氢、去氢等I相代谢反应,此外,还发生了半胱氨酸、谷胱甘肽结合反应。此研究结果,有助于探讨KDZI、IZ及DIZ的肝微粒体代谢规律,为其进一步的安全性、毒理学研究提供新的支持。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】

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本文编号：2437564