分化过程中Pkm2的表达特征及指示Pkm2表达的报告系统的建立

  本文关键词：分化过程中Pkm2的表达特征及指示Pkm2表达的报告系统的建立，，由笔耕文化传播整理发布。

《大连医科大学》 2015年

分化过程中Pkm2的表达特征及指示Pkm2表达的报告系统的建立

仉立强  

【摘要】：实验目的:1、探究基因Pk(Pyruvate Kinase)在小鼠胚胎干细胞、成纤维细胞及小鼠各个组织器官的表达情况,验证M2型丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase Subtype M2,Pkm2)在小鼠胚胎干细胞及诱导多能干细胞中高表达。2、探究ES细胞中及重编程过程中癌基因Pkm2,与Pkm2表达调控相关的部分基因的表达情况。探究分化过程中与分化相关的三个胚层基因的表达变化,Pkm2,Pkm1,多能性基因Nanog,Oct4及与Pkm2表达调控相关基因的表达变化,进一步验证干细胞与Pkm2的相互关系。3、胚胎干细胞中能够指示Pkm2表达的红色荧光报告系统的建立。4、利用转座子系统及能够指示Pkm2表达的红色荧光报告系统,筛选出对Pkm2的表达起调控作用的新基因、新蛋白,并进一步研究该基因及蛋白与Pkm2的相互作用及在重编程过程中的功能。实验方法:第一,得到由C57BL/6小鼠制备的小鼠成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblasts,MEF),来源于129系小鼠的胚胎干细胞R1及由MEF诱导来的多能干细胞Li PS-37,然后分别提取C57BL/6小鼠的各个组织、器官,通过实时定量PCR的方法,检测这些小鼠特定的组织、器官及MEF、R1、Li PS-37等细胞系中Pk三个同工酶(Pkm1、Pkm2、Pklr)的表达情况。同时,检测ES及重编程过程中Pkm2及与Pkm2表达调控相关的基因的表达情况,另外在小鼠胚胎干细胞R1中进行维甲酸(Retinoic Acid,RA)、去除白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor,LIF)和除去饲养细胞(Feeder Cell)或者是促进拟胚体(Embryoid Body,EB)的形成等处理,使得R1分化,观察在分化过程中基因Pkm1和Pkm2,多能性基因Nanog和Oct4,与胚胎发育相关的三个胚层的基因Pax6、Foxa2、Gata6的表达变化,以及与Pkm2调控相关的部分基因的表达变化。第二,借助于CRISPR/Cas9系统及同源重组的方法,根据小鼠胚胎干细胞染色体癌基因Pkm2的基因序列设计sg RNA及两个特定的同源臂,将能够编码红色荧光蛋白(Red Fluorescent Protein,RFP)的基因克隆到两个特定的同源臂之间,构建指示癌基因Pkm2红色荧光蛋白表达的载体,然后将这种载体瞬转到小鼠胚胎干细胞R1细胞系中,Cas9复合体能够通过向导序列(guide sequence)与DNA靶位点结合,在sg RNA存在的情况下,RFP会特异性的并插入到小鼠胚胎干细胞染色体Pkm2基因的特定位置,可以用来指示Pkm2在小鼠胚胎干细胞R1细胞系的表达情况,并且将得到的该细胞系进行分化处理,直接观察红色荧光的亮度变化。第三,利用转座子随机插入基因组的方法,在该指示Pkm2表达的红色荧光细胞系中筛选出能够对于红色荧光有影响的新基因、新蛋白,并进一步研究新基因、新蛋白与Pkm2的相互关系及在重编程过程中的功能。实验结果:(一)癌基因Pkm2的特异性表达及在分化、重编程过程中发挥着重要作用癌基因Pkm2特异性在小鼠胚胎干细胞R1、诱导多能干细胞Li PS-37中表达量较高,并且Pkm2在重编程过程中表达逐渐增高,在分化过程中表达逐渐降低。(二)建立红色荧光蛋白指示Pkm2表达的报告系统及阳性细胞系的纯化及扩增建系运用CRISPR/Cas9系统及同源重组的方法,将sg RNA及同源臂导入到癌基因Pkm2表达量较高的胚胎干细胞R1中,我们可以看到有红色荧光表达的阳性细胞,对这些阳性的细胞进行挑单克隆及扩增建系,最终得到了纯化的含有红色荧光表达的R1细胞系。(三)利用转座子随机筛选的方法筛选对Pkm2表达调控起作用的新基因、新蛋白我们首先在293T细胞中验证了该转座现象,为进一步在ES细胞及i PS细胞中筛选对Pkm2的表达起作用的新基因、新蛋白打下了坚实的基础。

【关键词】：
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.2;Q78
【目录】：

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