参知健脑方对缺氧致认知功能障碍大鼠线粒体损伤的保护机制的实验研究

发布时间：2019-06-01 11:04

【摘要】：背景认知功能障碍(cognitive impairment,CI)是指认知功能受到不同程度损害的状态,重者如各种类型痴呆,轻者如轻度认知功能障碍等。认知功能障碍在中医文献中没有专门记载,依据其临床表现,如记忆力下降等,可归属于中医学"健忘""善忘" "脑髓消""痴呆""呆病" "文痴"等病症范畴。痴呆病位在脑,正气亏虚为本,毒邪内停为标,其基本病机是本虚标实、虚实夹杂。治疗上以中医未病先防,既病防变的观点为指导,采用了扶正解毒的治则治法,应用了具有益气养血、滋阴清热功效的中药复方参知健脑方(SZJ)。缺氧时,线粒体呼吸链电子传递及氧化磷酸化发生障碍,进而导致电子传递链上酶活性抑制、氧化磷酸化水平降低,ATP合成减少、自由基产生增多等多种途径损害细胞,致突触减少,神经传导速度下降,神经元坏死或凋亡而出现临床认知功能下降表现。前期实验研究发现SZJ组分可明显改善A β所诱导的人神经母细胞瘤细胞株的神经毒性,并能有效改善AD大鼠模型的行为学。本研究将在既往研究基础上通过缺氧建立认知功能障碍大鼠模型,观察SZJ对缺氧致认知功能障碍模型大鼠学习记忆能力、β-淀粉样前体蛋白(βAPP)的含量、β-淀粉样蛋白(Aβ1-42)的含量以及8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)为标记物检测线粒体DNA损伤。初步探讨参知健脑方对大鼠脑线粒体损伤的保护作用机制,以及脑线粒体损伤与脏腑组织线粒体损伤之间的相关性,进而从中医的五脏整体观的角度阐释气虚对人体学习记忆能力的影响,并为其提供理论依据。最终为参知健脑方对认知功能障碍的预防及治疗提供实验依据。目的运用分子生物学的方法从线粒体角度观察参知健脑方对缺氧致认知功能障碍大鼠线粒体损伤的预防及保护机制。探讨缺氧时相关脏腑线粒体损伤与脑线粒体损伤的相关性,以及SZJ对其的保护和预防机制。从中医的五脏整体观的角度阐释气虚对人体学习记忆能力的影响,并为其提供理论依据,为参知健脑方的临床应用提供实验依据。内容与方法将老年大鼠分组,除正常组(A组)外按照实验要求给予缺氧处理,建立缺氧致线粒体损伤的认知功能障碍模型组(B组)以及参知健脑方干预组(C组),造模为期八周,第八周时利用Morris水迷宫对大鼠的学习记忆能力进行检测。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠脑及相关脏腑线粒体内β-淀粉样前体蛋白(βAPP)、β-淀粉样蛋白(Aβ1-42)的含量,采用大鼠8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)为标记物检测线粒体DNA的损伤。结果实验一,结果显示,各组大鼠逃避潜伏期的比较,第一天,正常组与模型组比较有极显著性差异(P0.01),正常组与干预组比较有显著性差异(P0.05),模型组与干预组比较有显著性差异(P0.05)。第二天,正常组与模型组比较有显著性差异(P0.05),正常组与干预组比较无显著性差异,模型组与干预组比较有极显著性差异。第三天,正常组与模型组比较有极显著性差异(P0.01),正常组与干预组比较有显著性差异(P0.05),模型组与干预组比较有极显著性差异(P0.01)。第四天,正常组与模型组比较有极显著性差异(P0.01),正常组与干预组比较无明显差异,模型组与干预组比较有极显著性差异(P0.01)。结果显示,各组大鼠定位航行实验总路程的比较,第一天,正常组与模型组比较有极显著性差异(P0.01),正常组与干预组比较无明显差异,模型组与干预组比较有极显著性差异(P0.01)。第二天,正常组与模型组比较有极显著性差异(P0.01),正常组与干预组比较有极显著性差异(P0.01),模型组与干预组比较有极显著性差异(P0.01)。第三天,正常组与模型组比较有极显著性差异(P0.01),正常组与干预组比较有极显著性差异(P0.01),模型组与干预组比较有极显著性差异(P0.01)。第四天,正常组与模型组比较有极显著性差异(P0.01),正常组与干预组比较有显著性差异(P0.05),模型组与干预组比较有极显著性差异(P0.01)。结果显示,空间探索原平台象限游泳时间/总时间中,正常组与模型组比较有极显著性差异(P0.01),正常组与干预组比较无显著差异,模型组与干预组比较有极显著性差异(P0.01)。结果显示,空间探索穿越目标平台次数,正常组与模型组比较有极显著性差异(P0.01),正常组与干预组比较无显著差异,模型组与干预组比较有极显著性差异(P0.01)。实验二,结果显示持续低压缺氧造模脑组织中APP含量浓度/脑组织蛋白浓度,模型组与正常组、SZJ干预组间均差异显著(P0.05)。结果显示持续低压缺氧造模脑组织中Aβ1-42含量浓度/脑组织蛋白浓度比较,模型组与正常组、SZJ干预组间均差异显著(P0.05)。结果显示持续低压缺氧造模脑组织中8-OHdG含量浓度/脑组织蛋白浓度模型组与正常组、SZJ干预组间比较有明显差异(P0.01),SZJ干预组与正常组间比较差异明显(P0.05)。结果显示持续低压缺氧造模脑组织中C0X含量浓度/脑组织蛋白浓度模型组与正常组有显著差异(P0.01),与SZJ干预组间有比较明显的差异(P0.05),SZJ干预组与正常组间比较无明显差异。实验三,持续低压缺氧造模八周后肾脏组织中线粒体DNA氧化损伤的检测正常组与模型组组间差异显著(P0.05),正常组与干预组组间无明显差异,模型组与干预组组间比较组间有明显差异(P0.05)。持续低压缺氧大鼠肾组织中COX含量浓度/肾组织蛋白浓度值比较造模八周后正常组与模型组组间差异显著(P0.05),正常组与干预组组间无明显差异(P0.05),模型组与干预组组间比较组间有明显差异(P0.05)。持续低压缺氧大鼠脾脏组织中线粒体DNA氧化损伤产物8-OHdG的检测正常组与模型组之间比较有极显著性差异(P0.01),正常组与干预组比较有极显著性差异(P0.01),模型组与干预组比较有显著性差异(P0.05)。脾脏组织中COX活性的表达,正常组与模型组比较有极显著性差异(P0.01),正常组与干预组比较无明显差异,模型组与干预组比较有极显著性差异(P0.01)。结果显示,持续低压缺氧大鼠心脏组织中线粒体DNA氧化损伤产物8-OHdG的检测正常组与模型组之间比较有显著性差异(P0.05),正常组与干预组比较无显著差异,模型组与干预组比较有显著性差异(P0.05)。心脏组织中COX活性的表达,正常组与模型组比较无显著性差异,正常组与干预组比较无明显差异,模型组与干预组比较无显著性差异。持续低压缺氧大鼠肝脏组织线粒体中COX活性的表达,正常组与模型组比较无显著性差异,正常组与干预组比较无明显差异,模型组与干预组比较无显著性差异。结论缺氧致认知功能障碍大鼠动物模型的建立成功。参知健脑方可以抑制APP、Aβ1-42在大鼠脑部的积累和DNA氧化损伤,保护脑线粒体进而发挥神经保护作用,进一步改善缺氧对认知功能障碍学习记忆能力的影响,为参知健脑方的临床应用提供实验支持。缺氧致Aβ1-42产生增多刺激神经细胞,大量Ca2+内流超载,线粒体肿胀功能紊乱,造成mtDNA缺失或突变,故缺氧致8-OHdG产量增多,即氧化损伤产物增多。缺氧造模时参知健脑方对线粒体有一定保护的作用,并对于缺氧造成的氧化损伤及COX酶的活性具有一定的保护作用,大鼠的空间记忆能力较模型组还是有一定改善,根据均数加减标准差可知,缺氧产生的8-OHdG越多对大鼠的认知功能影响越大。缺氧时相关脏腑线粒体损伤与脑线粒体损伤的具有一定的相关性,基本呈现正相关的趋势,为中医痴呆中脑与五脏整体观提供了依据。
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【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】