青藤碱联合白芍总苷对尿酸钠晶体诱导RAW264.7巨噬细胞MyD88、NF-κB、ASC、Caspase-1表达的影响

发布时间：2019-09-23 20:07

【摘要】：目的:急性痛风性关节炎(acute gouty arthritis,AGA)是尿酸盐晶体沉积于关节及其周围组织引起的一种急性炎症性风湿病。尿酸钠晶体(Monosodium urate,MSU)经常驻巨噬细胞识别、吞噬,通过My D88依赖性信号传导途径激活NF-κB,同时NLRP3炎性体经多种途径刺激后合成并被激活,最终释放大量IL-1β、TNF-α、IL-8等炎性因子,引起关节肿胀和剧烈疼痛。目前,AGA的常用治疗药物主要有秋水仙碱、糖皮质激素、非甾体类抗炎药及IL-1抑制剂等,但这些药物临床疗效不足,且毒副作用较大或价格昂贵,临床应用受到一定限制,亟待发掘更加安全有效的药物。中医学对痛风的认识历史悠久。近年来,从传统中医药中发掘安全有效抗急性痛风药物的研究日益受到重视。本实验在既往研究的基础上,通过建立尿酸钠晶体诱导RAW264.7巨噬细胞炎症模型,观察中药有效成分青藤碱(Sinomenine,SIN)、白芍总苷(total glucosides of paeony,TGP)及其联合应用对巨噬细胞炎性细胞因子、My D88-NF-κB和NLRP3炎性体信号通路中关键蛋白表达水平的影响,探讨中药有效成分青藤碱、白芍总苷及其联合应用对AGA的作用机制,为临床应用提供依据。方法:1建立MSU晶体诱导RAW264.7巨噬细胞炎症模型采用痛风性关节炎的关键炎性因子IL-1β表达值作为细胞造模成功的参考指标。分别用0、10、50、100、200、400、600、1000mg/L尿酸钠晶体混悬液刺激RAW264.7细胞,在3、6、12、24、48h取培养上清,用ELISA法检测IL-1β表达水平。2 MTT法检测细胞活力取对数生长期RAW264.7巨噬细胞接种于96孔板,细胞密度为5×104/m L,每孔200?l,置于37℃,5%CO2条件下培养过夜后更换为无血清DMEM培养液,分别设正常组(Control)(DMEM)、模型组(Model)(DMEM+终浓度50mg/L MSU)、秋水仙碱+尿酸钠组(Colchicine+MSU组)(DMEM+终浓度50mg/L MSU+终浓度1μmol/L Colchicine)、青藤碱+尿酸钠组(SIN+MSU组)(DMEM+终浓度50mg/L MSU+终浓度300μmol/L SIN)、白芍总苷+尿酸钠组(TGP+MSU组)(DMEM+终浓度50mg/L MSU+终浓度40mg/L TGP)、青藤碱+白芍总苷+尿酸钠组(SIN+TGP+MSU组)(DMEM+终浓度50mg/L MSU+终浓度300μmol/L SIN+终浓度40mg/L TGP)、秋水仙碱组(Colchicine组)(DMEM+终浓度1μmol/L Colchicine)、青藤碱组(SIN组)(DMEM+终浓度300μmol/L SIN)、白芍总苷组(TGP组)(DMEM+终浓度40mg/L TGP)、青藤碱+白芍总苷组(SIN+TGP组)(DMEM+终浓度300μmol/L SIN+终浓度40mg/L TGP),每组设6个复孔,37℃,5%CO2条件下培养24h后,另设调零孔(不加细胞和DMEM),各孔分别加入5 mg/m L MTT 20μl,继续孵育4h后,终止培养,小心吸弃孔内液体,每孔加入150μl DMSO,轻轻振荡10 min,使结晶充分溶解,酶标仪570 nm波长处测定各孔吸光度值(OD值),用各组细胞OD值与正常组OD值的百分比表示相对细胞存活率。3各实验组药物干预与指标检测将对数生长期RAW264.7巨噬细胞接种于6孔板,每孔加含血清DMEM培养液2ml,细胞密度为每孔1.5×106,置于37℃,5%CO2条件下培养过夜,吸弃上清,PBS洗1-2遍,更换无血清DMEM培养液,分别设Control组(DMEM)、Model组(DMEM+终浓度50mg/L MSU)、Colchicine组(DMEM+终浓度50mg/L MSU+终浓度1μmol/L Colchicine)、SIN组(DMEM+终浓度50mg/L MSU+终浓度300μmol/L SIN)、TGP组(DMEM+终浓度50mg/L MSU+终浓度40mg/L TGP)、SIN+TGP组(DMEM+终浓度50mg/L MSU+终浓度300μmol/L SIN+终浓度40mg/L TGP),每孔溶液终体积2ml,每组设3个复孔,37℃,5%CO2条件下培养24h,取培养液上清,4℃,3000转/分离心10min后取上清用于ELISA检测,或收集细胞用于western blot检测:(1)硝酸还原酶法检测各组巨噬细胞培养上清NO水平;(2)ELISA法检测各组巨噬细胞培养上清IL-1β、TNF-α、IL-8、MCP-1、MIF表达水平;(3)Western blot法检测各组巨噬细胞My D88、NF-κB、ASC、Caspase-1蛋白表达水平。4统计学方法应用SPSS 21.0统计软件,当数据符合正态分布方差齐时采用单因素方差分析(one way ANOVA),方差不齐时采用秩和检验,以P0.05认为差异具有统计学意义。结果:1 MSU晶体诱导RAW264.7巨噬细胞炎症模型的建立与0mg/L MSU刺激组相比,6h后50mg/L以上MSU刺激组IL-1β水平均开始升高,至24h达到峰值,48h时各刺激组IL-1β水平有所下降,在24h,50mg/L MSU刺激组IL-1β水平显著升高,与0mg/L组相比,差异有统计学意义(P0.05),且鉴于高浓度MSU可能对细胞活力产生影响,故选用50mg/L MSU晶体刺激巨噬细胞24h造模。2细胞活力与Control组相比,MSU、Colchicine+MSU、SIN+MSU、TGP+MSU、SIN+TGP+MSU、Colchicine、SIN、TGP、SIN+TGP分别处理的各组细胞相对细胞活力无显著改变。表明在此实验条件下,MSU、Colchicine、SIN、TGP没有明显的细胞毒作用。3各实验组巨噬细胞培养上清NO分泌水平与Control组相比,Model组分泌NO水平显著升高,差异有统计学意义(P0.05);与Model组相比,各用药组分泌NO水平显著降低,差异有统计学意义(P0.05);与Colchicine组相比,SIN组、TGP组及SIN+TGP组分泌NO水平明显升高,差异有统计学意义(P0.05);与SIN+TGP组相比,SIN组及TGP组分泌NO水平无明显差别,差异无统计学意义(P0.05)。4各实验组巨噬细胞培养上清IL-1β、TNF-α、IL-8、MCP-1、MIF表达水平与Model组相比,Colchicine组、SIN组、TGP组及SIN+TGP组IL-1β、TNF-α、IL-8、MCP-1、MIF的表达水平均明显降低,差异有统计学意义(P0.05);与Colchicine组相比,SIN+TGP组IL-1β、TNF-α、MCP-1、MIF的表达水平无明显差别,差异无统计学意义(P0.05),IL-8的表达水平明显升高,差异有统计学意义(P0.05);与Colchicine组相比,SIN组、TGP组IL-1β、TNF-α、IL-8、MCP-1的水平明显升高,差异有统计学意义(P0.05),SIN组MIF表达水平无明显差别,差异无统计学意义(P0.05),TGP组MIF表达水平明显升高,差异有统计学意义(P0.05);与SIN组相比,TGP组IL-1β、IL-8表达水平明显升高,差异有统计学意义(P0.05),TNF-α表达水平无明显差别,差异无统计学意义(P0.05);与SIN+TGP组相比,TGP组IL-8水平明显升高,差异有统计学意义(P0.05),SIN组IL-8表达水平无明显差别,差异无统计学意义(P0.05)。5各实验组巨噬细胞My D88、NF-κB、ASC、Caspase-1蛋白表达水平与Model组相比,Colchicine组、SIN组、TGP组及SIN+TGP组My D88、NF-κB、ASC、Caspase-1蛋白表达水平均明显降低,差异有统计学意义(P0.05);与Colchicine组相比,SIN+TGP组My D88、NF-κB蛋白表达水平无明显差别,差异无统计学意义(P0.05),SIN组、TGP组My D88、NF-κB蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义(P0.05);与Colchicine组相比,SIN组、TGP组及SIN+TGP组ASC、Caspase-1蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义(P0.05);与SIN组相比,TGP组NF-κB蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P0.05);与SIN+TGP相比,SIN组、TGP组ASC、Caspase-1蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。结论:1青藤碱、白芍总苷及其联合应用均能显著降低MSU晶体诱导RAW264.7巨噬细胞分泌NO、IL-1β、TNF-α、IL-8、MCP-1、MIF的水平,具有显著的抗炎作用;2青藤碱联合白芍总苷能够显著降低RAW264.7巨噬细胞炎症信号通路中My D88、NF-κB、ASC、Caspase-1蛋白表达水平,且效果优于二者单用;3植物中药有效成分青藤碱联合白芍总苷对MSU晶体诱导RAW264.7巨噬细胞炎症模型具有多靶点协同增效抗炎作用,可能是其治疗AGA的作用机制之一。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

【参考文献】