芪苈强心通过调节microRNA-21保护缺氧心肌微血管内皮细胞的功能机制研究

发布时间：2020-06-08 14:20

【摘要】：心力衰竭是指由各种心血管疾病导致的心功能不全的一种综合征,心肌梗死后心力衰竭是临床心力衰竭中最常见的类型,其发病机制主要包括心室重构、神经内分泌紊乱、细胞炎症因子激活及心肌能量代谢障碍等。心肌梗死后由于缺血及再灌注造成的微循环功能障碍,血管内皮细胞合成的NO减少而ET-1增多,导致血管舒张功能障碍;血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)活性升高,激活肾素-血管紧张素系统,加重心室重构,是促进心力衰竭发展的重要因素。近年来由于我国人口老龄化加重及心肌梗死患者生存率的提高,心力衰竭的患病率在逐年升高,尽管外科手术及介入技术可使急性心肌梗死患者早期得到再灌注治疗,心力衰竭诊断和治疗的指南不断更新,但心肌梗死后心力衰竭的防治仍然是一大挑战。芪苈强心胶囊是由黄芪、附子、人参、丹参、葶苈子、红花等11味中草药组成的通络药物,具有抑制心肌纤维化、抑制心肌细胞凋亡、改善心肌能量代谢、调节炎症因子等心脏保护功能。我们前期研究发现芪苈强心可抑制缺氧诱导的心肌微血管内皮细胞和心肌细胞凋亡,刺激HIF-1α和VEGF的表达,并可通过NRG-1/ErbB-PI3K/AKT信号通路促进缺氧条件下心肌微血管内皮细胞的血管新生功能。此外,我们还研究了芪苈强心对microRNA(miRNA,miR)的调控作用及信号通路分析。基于此,我们以缺氧心肌微血管内皮细胞为研究重点,以miRNA为研究靶点,探索miRNA在芪苈强心保护缺氧刺激的心肌微血管内皮细胞过程中发挥的作用,为研究芪苈强心治疗心力衰竭的机制提供新的方向。第一部分芪苈强心通过上调microRNA-21的表达减少缺氧条件下大鼠心肌微血管内皮细胞的凋亡目的探索microRNA在芪苈强心减少缺氧导致的心肌微血管内皮细胞凋亡过程中发挥的作用。方法植块法培养心肌微血管内皮细胞,传代细胞选择第二代(P2)进行后续实验。采用三气培养箱(1%02,5%CO2,94%N2,37℃)模拟缺氧环境。qRT-PCR方法检测microRNA的表达水平变化,筛选出在缺氧心肌微血管内皮细胞中表达发生变化的microRNA,并用芪苈强心干预,以进行microRNA的功能检测。细胞转染antagomir以抑制microRNA在细胞中的表达。采用原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡情况,采用Western Blot方法检测caspase-3和cleaved caspase-3表达变化。结果与对照组相比,缺氧组miR-221、miR-222、miR-214、miR-155表达无变化;miR-23b表达先升高,缺氧12小时后降低,加入芪苈强心干预后,miR-23b表达无变化(P0.01);而miR-21表达随缺氧时间延长而增加(P0.01),加入芪苈强心干预后,miR-21表达进一步增加(P0.01)。与芪苈强心干预组相比,miR-21表达抑制组细胞凋亡数量显著增加(P0.01),凋亡蛋白cleaved caspase-3/caspase-3 比值增高(P0.01)。结论芪苈强心可通过上调miR-21的表达,减少缺氧导致的心肌微血管内皮细胞凋亡。第二部分芪苈强心通过上调microRNA-21的表达促进缺氧条件下大鼠心肌微血管内皮细胞血管新生目的探索芪苈强心在缺氧条件下是否可以通过调节miR-21的表达发挥促进心肌微血管内皮细胞血管新生的功能及其相关机制研究。方法植块法培养心肌微血管内皮细胞,传代细胞至第二代进行分组干预。芪苈强心干预浓度为0.5mg/ml。采用三气培养箱(1%02,5%C02,94%N2,37°C)模拟缺氧环境。转染miR-21模拟物和抑制剂以促进和抑制miR-21在细胞的表达水平。将细胞随机分为7组进行干预:对照组,缺氧组,缺氧+antagomir组、缺氧+mimics组、缺氧+芪苈强心组,缺氧+antagomir+芪苈强心组,缺氧+mimics+芪苈强心组。采用细胞迁移实验、细胞增殖实验、成管实验检测心肌微血管内皮细胞的血管新生功能,qRT-PCR方法检测miR-21,HIF-1α和VEGF的mRNA表达水平。结果与缺氧+芪苈强心组相比,抑制miR-21的表达后,芪苈强心促进血管新生的功能减弱,表现在细胞迁移和增殖减慢,成管数和成环数减少,HIF-1α和VEGF的mRNA表达水平降低(P0.05或P0.01);而过表达miR-21,细胞迁移和增殖加快,成管数和成环数增加,HIF-1α和VEGF的表达水平增加(P0.05或P0.01),芪苈强心促进血管新生的作用进一步增强。结论在缺氧条件下,芪苈强心可通过促进miR-21的表达发挥保护心肌微血管内皮细胞血管新生的功能。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

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