防己黄芪颗粒含药血清对IgA肾病患者外周血单个核细胞中淋巴细胞亚群的影响

发布时间：2020-10-29 14:36

　　 IgA肾病是青壮年肾功能不全的重要病因,占我国原发性肾小球肾炎的20%~45.26%,该病是一组临床表现主要为血尿,可伴有高血压、蛋白尿和肾功能受损等的一种疾病。现已有学者提出“多重打击机制”等发病学说,但造成该病肾脏损伤的机制尚未完全阐明,且并未出现治疗该病的特异性方法。目前,糖皮质激素等免疫抑制剂虽然取得一定临床疗效,但其副作用较大,临床使用受限,而中医治疗该病在近几年取得了一定的成果,我科的前期实验证明了防己黄芪汤的有效成分汉防己甲素能在一定浓度下有效抑制健康志愿者外周血淋巴细体内胞的增殖并协同增强糖皮质激素的免疫能力,且防己黄芪汤在治疗IgA肾病的临床效果较好,能有效改善患者血尿、蛋白尿等临床症状,并延缓疾病进展,故本文选用优化后的院内制剂防己黄芪颗粒进行实验。目的:研究防己黄芪颗粒含药血清对IgA肾病患者外周血单个核细胞中CD4~+T/CD8~+T比值和CD4~+CD25~+T细胞亚群的影响,从而探讨防己黄芪颗粒治疗IgA肾病的作用机制。方法:1)含药血清制备:选取志愿者10名,5女5男,年龄20~35岁。干预之前,晨起空腹抽取肱静脉血20ml,离心并处理血清,为空白对照组,随后志愿者开始服用防己黄芪汤颗粒剂,连续服用6天,处理分离血清,第6天早晨空腹抽取肱静脉血20ml并处理分离血清,用作含药血清。2)人外周单个核细胞(PBMC)的提取:从我科的慢性肾脏病队列研究中收集10例CKD2~3期的IgA肾病患者,5男5女,每人收集15ml新鲜全血通过密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。3)运用CCK-8法检测健康人空白血清与10%胎牛血清作用的等效性,确定后续试验培养外周单个核细胞的含药血清干预浓度。4)细胞分组及干预:将分离的正常人和IgA肾病患者的PBMC分为模型组、正常组、治疗组、对照组并进行相应干预,干预后培养48h,随后检测相应指标。5)培养48h后通过流式细胞仪检各组淋巴细胞亚群。结果:1)通过CCK-8法测定选取10%浓度的空白血清以及含药血清作为后续试验的干预浓度,10%的人空白血清对人外周单个核细胞的细胞增值率与10%FBS相比,并无统计学差异。(P0.05)2)与正常人组相比,IgAN患者组的CD4~+T/CD8~+T的比值并无统计学差异(P0.05)3)与正常人组相比,IgAN患者组的CD4~+TCD25~+T的比值有显著统计学差异(P0.05)4)防己黄芪颗粒含药血清调节前后的正常人CD4~+T/CD8~+T的比值并无统计学差异(P0.05)5)防己黄芪颗粒含药血清调节前后的IgAN的CD4~+CD25~+T的比值具有显著统计学差异(P0.05)结论:用10%防己黄芪颗粒含药血清进行干预,研究发现,正常人组与IgAN患者组相比,CD4~+T/CD8~+T的比值并无统计学差异,证实对于CKD2~3期的患者而言,CD4~+T/CD8~+T比值分布的差异并不显著,并不能作为IgAN早期生物诊断标准;与正常人相比,IgAN患者的CD4~+TCD25~+T淋巴细胞显著低于对照组(P0.05),提示CD4~+CD25~+T淋巴细胞分布与IgAN肾病相关,表明IgAN患者存在免疫失调,表现为Treg的下降。本研究同样证实防己黄芪颗粒含药血清可以有效上调该病患者的CD4~+TCD25~+T淋巴细胞,具有免疫调节功能,延缓疾病进展。
【学位单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R277.5
【部分图文】：

防己黄芪颗粒含药血清对IgA肾病患者外周血单个核细胞中淋巴细胞亚群的有影响79)计数：根据实验不同需要进行计数,用细胞计数仪记录细胞的增殖情况。加样枪充分混匀每个样本后计数,吸取少量细胞悬液于血细胞计数板计数,每样品浓度四次计数的平均值。记录细胞浓度与培养液体积的乘积作为当次统计时淋巴细胞的总量。计算细胞活力，调节细胞初始浓度至1×105,取1ml转入完全培养皿,于CO2培养箱中培养,条件为37℃、5%CO2、饱和湿度。2.4.1.CCK-8法确定健康志愿者血清的加入浓度1)将前面新鲜分离备用的PBMC悬液取出，并用RPMI1640培养液将细胞吹打调整为1×105个/ml密度的细胞悬液。2)在96孔板中配置100μl（大约含有10000个细胞）的淋巴细胞悬液。将培养板置于37°C、5%CO2恒温细胞培养箱预培养24小时（37℃，5%CO2）。待细胞融合度达到70%-80%后吸弃旧培养液，向培养板加同浓度的空白血清和conA（具体浓度见下表）。3)将培养板在培养箱孵育24小时。4)向每孔加入10μlCCK8溶液。5)将培养板在培养箱内孵育2-5小时。6)用酶标仪测定在420nm处的吸光度。图1密度梯度离心法示意图图2密度梯度离心法实图

防己黄芪颗粒含药血清对IgA肾病患者外周血单个核细胞中淋巴细胞亚群的有影响79)计数：根据实验不同需要进行计数,用细胞计数仪记录细胞的增殖情况。加样枪充分混匀每个样本后计数,吸取少量细胞悬液于血细胞计数板计数,每样品浓度四次计数的平均值。记录细胞浓度与培养液体积的乘积作为当次统计时淋巴细胞的总量。计算细胞活力，调节细胞初始浓度至1×105,取1ml转入完全培养皿,于CO2培养箱中培养,条件为37℃、5%CO2、饱和湿度。2.4.1.CCK-8法确定健康志愿者血清的加入浓度1)将前面新鲜分离备用的PBMC悬液取出，并用RPMI1640培养液将细胞吹打调整为1×105个/ml密度的细胞悬液。2)在96孔板中配置100μl（大约含有10000个细胞）的淋巴细胞悬液。将培养板置于37°C、5%CO2恒温细胞培养箱预培养24小时（37℃，5%CO2）。待细胞融合度达到70%-80%后吸弃旧培养液，向培养板加同浓度的空白血清和conA（具体浓度见下表）。3)将培养板在培养箱孵育24小时。4)向每孔加入10μlCCK8溶液。5)将培养板在培养箱内孵育2-5小时。6)用酶标仪测定在420nm处的吸光度。图1密度梯度离心法示意图图2密度梯度离心法实图

防己黄芪颗粒含药血清对IgA肾病患者外周血单个核细胞中淋巴细胞亚群的有影响79)计数：根据实验不同需要进行计数,用细胞计数仪记录细胞的增殖情况。加样枪充分混匀每个样本后计数,吸取少量细胞悬液于血细胞计数板计数,每样品浓度四次计数的平均值。记录细胞浓度与培养液体积的乘积作为当次统计时淋巴细胞的总量。计算细胞活力，调节细胞初始浓度至1×105,取1ml转入完全培养皿,于CO2培养箱中培养,条件为37℃、5%CO2、饱和湿度。2.4.1.CCK-8法确定健康志愿者血清的加入浓度1)将前面新鲜分离备用的PBMC悬液取出，并用RPMI1640培养液将细胞吹打调整为1×105个/ml密度的细胞悬液。2)在96孔板中配置100μl（大约含有10000个细胞）的淋巴细胞悬液。将培养板置于37°C、5%CO2恒温细胞培养箱预培养24小时（37℃，5%CO2）。待细胞融合度达到70%-80%后吸弃旧培养液，向培养板加同浓度的空白血清和conA（具体浓度见下表）。3)将培养板在培养箱孵育24小时。4)向每孔加入10μlCCK8溶液。5)将培养板在培养箱内孵育2-5小时。6)用酶标仪测定在420nm处的吸光度。图1密度梯度离心法示意图图2密度梯度离心法实图
【参考文献】

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本文编号：2861039