GLP-1和Gcg双受体激动剂改善阿尔茨海默病转基因小鼠认知功能障碍的行为电生理研究

发布时间：2020-11-17 02:57

　　 目的:阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是一种以记忆力损害为主要表现的神经退行性疾病。近年来大量流行病学研究发现:Ⅱ型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)与AD之间存在者强烈的病理生理学联系。抗糖尿病药物也日益成为了治疗AD的一个研究热点。胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide 1,GLP-1)是由肠道细胞分泌的通过刺激胰岛素、抑制升糖激素、抑制胃排空和让胰岛细胞重生的方式降低血糖的一种肠促胰岛素。近些年,关于GLP-1受体激动剂用于神经退行性疾病的研究越发得到认可。随后研究者们为了不断提高药物疗效和半衰期合成了越来越多的类似物用于临床治疗和科学研究。本课题组的前期研究表明:基于GLP-1受体激活后发挥的神经保护作用,其多种类似物均具有一定改善AD患者或动物模型的学习记忆、突触可塑性、Aβ清除等多方面的抗AD效应。其中,一种GLP-1和胰高血糖素(Glucagon,Gcg)双受体激动剂(D-ser2)oxm对原代海马神经元可以通过抑制钙超载发挥抗凋亡的神经保护作用,并且可以显著改善AD转基因小鼠的空间学习记忆能力、工作记忆、突触可塑性以及清除Aβ沉积等抗AD效应。通过前期研究结果我们猜测该神经保护作用可能与同时激活GLP-1和Gcg两种受体,经过一系列信号通路蛋白的调整作用,纠正了脑内神经元的糖代谢平衡,最终有效的减少了神经元的损害。然而,众所周知大脑形成与维持记忆的根本原理是神经细胞发出正常的电信号在神经网络中相互传递而实现的。据报道,AD患者脑内会出现电活动异常并且这种现象要早于Aβ或Tau的病理性改变。所以,我们怀疑(D-ser2)oxm在改善AD病理表型的机制中可能还有电生理学的贡献。由此,本研究利用无线神经遥测技术结合行为学检测手段,同步记录AD转基因小鼠在腹腔注射双受体激动剂(D-ser2)oxm后的行为学表现以及海马脑区场电位(Local field potential,LFP)的Theta节律变化,以期揭示(D-ser2)oxm对AD的认知功能与电活动的相关性作用机制。除此之外,我们发现AD转基因小鼠在行为实验过程中还伴随着LFP中Gamma节律和峰电位(Spike)发放异常,故本课题选用低月龄AD转基因小鼠观察在AD发病早期LFP(Gamma节律)与Spike的发放情况,并试图采用数学中的熵值概念初步分析AD发病早期多种电活动变化之间存在的相关性,旨在为今后深入了解AD发生发展的电生理机制,并发掘新的治疗策略提供理论依据。材料与方法:本课题分为两个部分:(1)观察9月龄APP/PS1/tau转基因小鼠(3xTg)在给予(D-ser2)oxm之后,在工作记忆和恐惧记忆行为进行中海马组织场电位(LFP)Theta节律的同步变化情况;(2)6月龄3xTg小鼠在条件性恐惧记忆形成与维持中LFP(Gamma节律)和峰电位(Spike)的相关性分析。第一部分实验:(1)选用9月龄雄性3xTg小鼠和同月龄C57背景小鼠各20只,分别腹腔注射(D-ser2)oxm和生理盐水(saline)两周,因此分为WT+saline、WT+(D-ser2)oxm、3xTg+saline和3xTg+(D-ser2)oxm四组小鼠模型;(2)对每组小鼠海马CA1区埋置多通道电极:(3)埋置电极两周后进行Y迷宫、恐惧惊跳箱行为学实验,同步记录各组小鼠LFP中Theta节律峰值和频率的变化情况;(4)最后采用Golgi染色,观察海马组织内神经元树突棘的密度。第二部分实验:(1)选用6月龄雄性3xTg小鼠和同月龄C57对照小鼠(WT)各10只,分别命名为3xTg组和WT组;(2)海马内埋置电极后两周进行条件恐惧箱的行为实验;(3)通过在其头部埋置的无线遥测装置同步监测两组小鼠在恐惧惊跳箱实验中对照僵直比(freezing ratio)分析一系列电生理指标(Gamma节律、Spike、Burst)之间的变化情况,最后使用熵值计算Gamma节律与Spike的相关性。结果:(D-ser2)oxm药物实验结果显示:(1)Y迷宫中,3xTg小鼠比正常WT小鼠的自发交替正确率明显降低,给予(D-ser2)oxm之后3xTg小鼠的工作记忆得到了显著的改善。与此同时,3xTg小鼠的Theta节律峰值功率出现降低,但给予药物(D-ser2)oxm治疗后Theta节律也如同行为学结果得到了提升;(2)在恐惧惊跳实验训练阶段,随着强化次数的增加,四组小鼠僵直比率均逐渐增加,训练开始与结束时四组小鼠之间的僵直比率无明显差异,表明APP/PS1/tau基因和(D-ser2)oxm对条件性恐惧学习过程没有显著影响。但在第二天检测阶段,3xTg小鼠由条件性刺激(CS)诱发的僵直比率较WT小鼠明显降低,给与(D-ser2)oxm治疗后僵直比率显著增多;(3)3xTg小鼠在CS阶段Theta发放功率低于WT小鼠,说明3xTg小鼠恐惧记忆能力受到的损害。给与(D-ser2)oxm治疗后3xTg小鼠在CS阶段的峰值和频率均有所恢复;(4)Golgi染色的结果显示,3xTg小鼠海马CA1区域神经元树突棘密度降低,经过(D-ser2)oxm治疗后树突棘数量与密度均显著增加。Gamma和Spike的相关性实验结果显示:(1)恐惧惊跳箱行为学实验阶段3xTg小鼠Gamma节律发放明显低于WT小鼠;(2)WT小鼠的Spike发放明显高于3xTg小鼠;(3)3xTg小鼠发放的电活动暴发(Burst)明显低于WT小鼠;(4)随后我们使用LFP(Gamma节律)和Spike的熵值计算方式发现WT小鼠的此两种电活动存在较高的相关性,而3xTg小鼠的相关性却较差。结论:(D-ser2)oxm能有效改善3xTg小鼠的短时程工作记忆及其条件性恐惧记忆,并恢复了突触结构性损伤,同时改善了其行为学所伴随的Theta节律异常。另外,AD条件性恐惧记忆的缺陷可能是由于Spike-LFP(Gamma)发放不协调导致的。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R749.16
【部分图文】：

9图1Y迷宫自发交替正确率及其相伴随的Theta节律A：各组小鼠在Y迷宫中的自发交替正确比率。B：各组小鼠的总进臂次数。C：各组小鼠在Y迷宫中进入正确臂5s内的Theta节律发放对比。D：各组小鼠在Y迷宫中进入正确臂5秒内的Theta节律发放的峰值功率统计。（n=10,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001）

10图2各组小鼠的条件恐惧记忆实验结果A：各组小鼠在恐惧惊跳箱训练期间的僵直比率。B：各组小鼠在恐惧惊跳箱训练期间第一次强化前和五次强化后的僵直比率统计。C:各组小鼠在恐惧惊跳箱测试阶段条件刺激前和条件刺激后僵直比率统计。D:各组小鼠在恐惧惊跳箱测试阶段条件刺激前和条件刺激后僵直比率。（n=10,**P<0.01,***P<0.001）2.3（D-ser2）oxm对3xTg小鼠的恐惧记忆及其Theta节律的影响同时，通过LFP频谱分析我们发现频率为4-10Hz的Theta节律在第二天测试阶段时频图出现显著差异，尤其是对应动物在僵直状态时Theta发放功率出现了明显变化（如图3）。图3显示了不同组别的四例小鼠在测试阶段典型的原始Theta节律波形图、压力感受曲线及其相对应的时频热图。我们观察到3xTg小鼠无论在Pre-CS阶段还是CS阶段Theta原始波形的发放、压力感受曲线及其相对应的时频热图均无显著的差异，给予(D-ser2)oxm治疗后情况得到了改善。图4A显示了四组小鼠在测试阶段典型的峰值频率图。图4B、4C显示在恐惧惊跳箱测试期间条件刺激前和条件刺激后各组小鼠CA1区域theta节律发放的峰值频率统计图及其峰值功率统计图。我们观察到WT小鼠在CS阶段Theta节律的发放频率较Pre-CS阶段增强，而3xTg小鼠在CS阶段Theta发放功率低于WT小鼠，说明3xTg小鼠在CS阶段3xTg小鼠恐惧记忆能力受到的损害伴随海马

11CA1区Theta发放功率的下降。给与(D-ser2)oxm治疗后3xTg小鼠在CS阶段的峰值和频率均有所恢复(P<0.05)。说明给与(D-ser2)oxm治疗后3xTg小鼠在CS阶段3xTg小鼠恐惧记忆能力受到的损害伴随海马CA1区Theta发放功率的下降可以经过给予(D-ser2)oxm治疗得到改善。图3各组小鼠在恐惧惊跳箱中原始波形图、压力感受曲线及其相对应的时频热图实验结果A:在恐惧惊跳箱中同步记录的WT+Saline组的行为电生理。B:在恐惧惊跳箱中同步记录的WT+Oxm组的行为电生理。C:在恐惧惊跳箱中同步记录的3xTg+Saline组的行为电生理。D:在恐惧惊跳箱中同步记录的3xTg+Oxm组的行为电生理。(上图为典型的原始Theta波形，中图为压力感受曲线，下图为相对应的时频热图)
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本文编号：2887004