人iPSCs分化成视网膜类器官的在体移植及生物力学研究

发布时间：2020-12-07 15:44

　　视网膜变性（Retina degeneration,RD）相关疾病可导致视网膜细胞逐渐丢失,进而发生视功能障碍甚至致盲。目前视网膜感光细胞的细胞替代治疗是较有前景的研究方向,但仍需寻找合适来源的移植细胞和移植手段。为了探究人诱导多能干细胞（human-induced pluripotentstemcells,hiPSCs）体外向视网膜类器官（Retinaorganoids,ROs）的分化进程并进行在体细胞移植的尝试,我们采用3D培养方法,获得具有典型视网膜结构的ROs。结合实时荧光定量PCR法和免疫荧光染色,我们系统地鉴定诱导分化进程及效果。形态学和组织染色结果证明,ROs可模拟人胚胎视网膜发育进程和经典分子标记物的时空表达。我们将ROs在体移植至Gnat1-/-小鼠视网膜内,观察其存活及整合情况。结果显示,ROs细胞移植三周后,自身带有绿色荧光的细胞成功在宿主小鼠的视网膜外核层中长期存活,移植4-6月后植入细胞表达功能性光信号转导蛋白GNAT1。证实了移植的ROs细胞能在受体小鼠眼内长期稳定存活,进入外核层并进一步发育成熟为类感光细胞。另外,在诱导分化前期贴壁培养集落的过程中,我们发... 

【文章来源】：中国科学技术大学安徽省 211工程院校 985工程院校

【文章页数】：68 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１．２光信号转导过程示意图??（Ｌａ?ｒｅｔｉｎａ，?ｌａ?ｆｏｔｏｔｒａｎｓｄｕｃｃｉｏｎ，?Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ?ｄｅ?Ｃｏｓｔａ?Ｒｉｃａ）??（２）视觉循环：光异构化将１１－顺式视黄醛转化为外段中的所有反式视黄??“”

内的具体位置。根据细胞的功能不同，有些细胞更容易受到一些压??力的影响。事实上，不仅仅是高度特化的细胞，如参与听力的毛细胞，或触摸敏??感的神经元能够感觉这些刺激，其实每个细胞都有感觉和响应机械压力的能力。??应力通过细胞外基质（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ，ＥＣＭ）从全身系统传递到器官、组织??和细胞。应力传递到细胞水平的程度在很大程度上取决于细胞周边的机械行为、??细胞外基质和细胞本身的相对物质属性。作用在细胞上的三种基本的机械应力是??拉力、压缩力和剪切力［１２５］（图１．３）。??Ｓｈｅａｒ??＾?Ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ??Ｔｅｎｓｉｏｎ??图１．３细胞水平的机械应力作用??（Ｓｐａｓｉｃ?Ｍ，?ｅｔ?ａｌ．．?Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ?Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，?２０１１）??机械应力传递到细胞水平，产生的力的大小和位置取决于机械环境和细胞的??机械性能。细胞可以免受压力，或者相反，压力可以集中在特定的位置。细胞具??有机械感觉能力，能够将机械信号转换成生化反应。有多种不同的机械信号作用??于细胞，有多种蛋白参与信号转导，反应范围从细胞骨架排列的短期变化到基因??表达的长期变化。通常，机械信号通过特化蛋白或蛋白复合物转化为生化信号，??协调的反应使细胞适应不断变化的机械条件，进而调节组织形态和重塑。??１２??

?第３章实验结果与结论???第３章实验结果与结论??３．１．?ＢＣｌ－ｅＧＦＰ细胞的贴壁培养及自组装分化??ＢＣｌ－ｅＧＦＰ细胞首先在包被Ｇｅｌｔｒｅｘ的孔板里贴壁培养，细胞呈多角形或梭??形，细胞质饱满，细胞膜清晰可见并稳定表达绿色突光蛋白（Ｇｒｅｅｎ?ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ??ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ），细胞核呈椭圆形，多位于细胞中央。培养５－７天后，贴壁培养的??单层细胞不断分裂扩增，成镶嵌样紧密排列长满培养皿。当细胞融合约９０％及以??上时，消化刮取的细胞团块呈不定形态，边缘卷曲，透亮，大小约４５０ｐｍ为宜，??悬浮培养开始自组装成神经球。Ｄａｙ７神经球大小为２２０±５〇ｎｍ，内部呈灰黑色，??组织疏松，外层透亮且较为紧致（图３．１）。??＠■１?ＥＨ??图３．１显微镜下观察体外培养的ＢＣｌ－ｅＧＦＰ细胞和神经球自组装过程（标尺＝５０〇ｎｍ）??图注：（Ａ）单层贴壁培养的细胞呈多角形或梭形，细胞质饱满，细胞膜清晰可见。（Ｂ）??单层贴壁培养的细胞表达ＧＦＰ。（Ｃ）细胞增殖大量融合时酶解，刮取并悬浮培养??的细胞团块，大小约为４５〇ｎｍ。（Ｄ）Ｄａｙ７细胞团块自组装成大小为２２０±５〇ｎｍ的??神经球，内部呈灰黑色，组织疏松，外层透亮且紧致。??２９??


本文编号：2903516