基于核酸序列依赖扩增技术诊断侵袭性念珠菌病的实验研究
发布时间：2021-01-21 02:59
目的:侵袭性念珠菌病（invasive candidiasis,IC）是一种临床症状和体征不典型,且发病率和病死率逐年增高的感染性疾病。早期的诊断和治疗有助于提高患者生存率并改善患者预后。本研究拟构建核酸序列依赖扩增（nucleic acid sequence-based amplification,NASBA）技术检测念珠菌,用于快速诊断IC,并结合G试验和血培养结果,确定实验室诊断IC的最佳方案。方法:首先确定针对念珠菌属18S rRNA的高度保守序列的引物,建立NASBA结合电泳检测白色念珠菌标准株（ATCC14053）的方法,并对其灵敏度和特异性进行评估。然后,参照EORTC/MSG对侵袭性真菌病定义的标准,拟定IC阳性病例组和排除IC的阴性对照组的纳入标准,收集并最终纳入统计38例临床样本（病例组18例（确诊15例,拟诊3例）,对照组20例）,应用本研究构建的NASBA法进行检测,收集所有病例的血培养和G试验检查结果,并计算三种方法的诊断性能参数。结果:NASBA产物电泳结果显示临床七种不同的念珠菌（白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、都柏林念珠菌、...
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
NASBA法结合电泳检测白色念珠菌的灵敏度评价Fig1.1SensitivityevaluationofNASBAcombinedwithelectrophoresisassayfordetecting
重庆医科大学硕士研究生学位论文14图1.1NASBA法结合电泳检测白色念珠菌的灵敏度评价Fig1.1SensitivityevaluationofNASBAcombinedwithelectrophoresisassayfordetectingCandidaalbicans注：M为DL5000bpmarker，1-6分别为电泳检测NASBA扩增105CFU/ml、104CFU/ml、103CFU/ml、102CFU/ml、101CFU/ml、1CFU/ml白色念珠菌的结果。3.2特异性评价如图1.2和图1.3所示，本次实验建立的NASBA结合电泳法检测7种不同念珠菌株呈阳性结果，而其他非念珠菌真菌及细菌均呈阴性结果。表明特异性良好。图1.2念珠菌属不同菌株经NASBA扩增后的电泳结果Fig1.2ElectrophoresisresultsofdifferentspeciesofCandidaamplifiedbyNASBA注：M为DL500bpmarker，1-7分别为电泳检测NASBA扩增白色念株菌ATCC14053、近平滑念珠菌ATCC22019、克柔念珠菌ATCC6258、热带念珠菌（临床分离菌株）、光滑念珠菌ATCC2950、都柏林念珠菌（临床分离菌株）、季也蒙念珠菌（临床分离菌株）的菌株RNA结果。
重庆医科大学硕士研究生学位论文15图1.3各种非念珠菌属菌株经NASBA扩增后的电泳结果Fig1.3Electrophoresisresultsofvariousnon-CandidastrainsamplifiedbyNASBA注：M为DL1000bpmarker，1-9分别为电泳检测NASBA扩增新型隐球菌（临床分离菌株）、烟曲霉（ATCCMYA-3626）、金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌（ATCC27853）、纹带棒状杆菌（临床分离菌株）、艰难梭菌（ATCC43255）、新型隐球菌（临床分离菌株）、烟曲霉（ATCCMYA-3626）的菌株RNA结果。4讨论念珠菌是一种广泛存在于自然界，同时也是寄居在人体最常见的真菌。一般认为，念珠菌是人体皮肤、口腔、阴道、胃肠道等与外界相通部位的正常菌群成员，不会导致深部器官或组织感染。当人体免疫力低下、生理屏障破坏、菌群失调时，念珠菌可侵入人体组织、器官、血液，导致IC的发生[3,28,29]。及时、准确诊断IC是指导临床正确管理IC患者的关键。传统的念珠菌培养法和组织病理学检查存在检验周期长和敏感性低的缺陷，某些情况下还需对患者进行侵入性操作才能采集标本送检。检测血清标志物BDG在一定程度可降低检验周转时间，达到早期、快速的诊断需求，但其诊断IC的假阳性问题突出，不能满足临床准确诊断IC的需求。分子检测技术是诊断感染性疾病的发展方向，传统PCR法存在复杂的热变性过程，对仪器设备的精密程度要求较高，且存在外源性DNA污染的问题，尽管目前多种基于PCR的分子诊断技术被研发用于诊断IC，但尚无标准化操作程序[5]。NASBA技术相较于PCR技术的优势在于以单链RNA为模板，在AMV逆转
【参考文献】：
硕士论文
[1]核酸序列依赖扩增技术检测侵袭性曲霉菌感染的实验研究[D]. 王立朋.重庆医科大学 2014
[2]基于NASBA技术检测细菌耐药性方法的建立[D]. 贺尔娜.宁波大学 2014
本文编号：2990319
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
NASBA法结合电泳检测白色念珠菌的灵敏度评价Fig1.1SensitivityevaluationofNASBAcombinedwithelectrophoresisassayfordetecting
重庆医科大学硕士研究生学位论文14图1.1NASBA法结合电泳检测白色念珠菌的灵敏度评价Fig1.1SensitivityevaluationofNASBAcombinedwithelectrophoresisassayfordetectingCandidaalbicans注：M为DL5000bpmarker，1-6分别为电泳检测NASBA扩增105CFU/ml、104CFU/ml、103CFU/ml、102CFU/ml、101CFU/ml、1CFU/ml白色念珠菌的结果。3.2特异性评价如图1.2和图1.3所示，本次实验建立的NASBA结合电泳法检测7种不同念珠菌株呈阳性结果，而其他非念珠菌真菌及细菌均呈阴性结果。表明特异性良好。图1.2念珠菌属不同菌株经NASBA扩增后的电泳结果Fig1.2ElectrophoresisresultsofdifferentspeciesofCandidaamplifiedbyNASBA注：M为DL500bpmarker，1-7分别为电泳检测NASBA扩增白色念株菌ATCC14053、近平滑念珠菌ATCC22019、克柔念珠菌ATCC6258、热带念珠菌（临床分离菌株）、光滑念珠菌ATCC2950、都柏林念珠菌（临床分离菌株）、季也蒙念珠菌（临床分离菌株）的菌株RNA结果。
重庆医科大学硕士研究生学位论文15图1.3各种非念珠菌属菌株经NASBA扩增后的电泳结果Fig1.3Electrophoresisresultsofvariousnon-CandidastrainsamplifiedbyNASBA注：M为DL1000bpmarker，1-9分别为电泳检测NASBA扩增新型隐球菌（临床分离菌株）、烟曲霉（ATCCMYA-3626）、金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌（ATCC27853）、纹带棒状杆菌（临床分离菌株）、艰难梭菌（ATCC43255）、新型隐球菌（临床分离菌株）、烟曲霉（ATCCMYA-3626）的菌株RNA结果。4讨论念珠菌是一种广泛存在于自然界，同时也是寄居在人体最常见的真菌。一般认为，念珠菌是人体皮肤、口腔、阴道、胃肠道等与外界相通部位的正常菌群成员，不会导致深部器官或组织感染。当人体免疫力低下、生理屏障破坏、菌群失调时，念珠菌可侵入人体组织、器官、血液，导致IC的发生[3,28,29]。及时、准确诊断IC是指导临床正确管理IC患者的关键。传统的念珠菌培养法和组织病理学检查存在检验周期长和敏感性低的缺陷，某些情况下还需对患者进行侵入性操作才能采集标本送检。检测血清标志物BDG在一定程度可降低检验周转时间，达到早期、快速的诊断需求，但其诊断IC的假阳性问题突出，不能满足临床准确诊断IC的需求。分子检测技术是诊断感染性疾病的发展方向，传统PCR法存在复杂的热变性过程，对仪器设备的精密程度要求较高，且存在外源性DNA污染的问题，尽管目前多种基于PCR的分子诊断技术被研发用于诊断IC，但尚无标准化操作程序[5]。NASBA技术相较于PCR技术的优势在于以单链RNA为模板，在AMV逆转
【参考文献】：
硕士论文
[1]核酸序列依赖扩增技术检测侵袭性曲霉菌感染的实验研究[D]. 王立朋.重庆医科大学 2014
[2]基于NASBA技术检测细菌耐药性方法的建立[D]. 贺尔娜.宁波大学 2014
本文编号：2990319
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