S1PR3促进急性T淋巴细胞白血病体内外进展研究
发布时间：2021-01-21 05:33
第一部分构建稳定敲低S1PR3基因的T-ALL细胞系目的:通过鞘氨醇-1-磷酸盐受体3（Sphingosine-1-phosphate receptor 3,S1PR3）siRNA逆转录病毒载体技术,构建稳定敲低S1PR3的多个T淋巴细胞白血病（T cell acute lymphocytic leukemia,T-ALL）细胞系（Jurkat、Cutll1和Molt-4细胞）。方法:通过构建S1PR3 siRNA逆转录病毒载体,包装与浓缩病毒,分别感染多个T-ALL细胞系（Jurkat、Cutll1和Molt-4细胞）,利用q-PCR和Western blot检测病毒感染细胞后S1PR3的表达。结果:成功构建S1PR3 siRNA逆转录病毒载体;q-PCR和Western blot结果显示成功建立稳定敲低S1PR3的多个T-ALL细胞系（Jurkat、Cutll1和Molt-4细胞）。结论:成功建立稳定敲低S1PR3基因的多个T-ALL细胞系（Jurkat、Cutll1和Molt-4细胞）,为后续的研究提供实验材料。第二部分S1PR3对T-ALL细胞功能的影响目的:明确S1PR3对多...
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
敲低S1PR3重组质粒的构建100100
重庆医科大学硕士研究生学位论文21以SEB-361逆转录病毒载体为骨架，设计针对S1PR3基因的序列（图1.1A）。通过华大基因公司合成目的片段，进行基因克隆（图1.1B），构建敲低S1PR3重组逆转录病毒质粒。挑取平板中的菌落进行PCR，在挑取的20个菌落中有8个产物经琼脂糖凝胶电泳后在501bp处有一条明亮的单一条带，产物大小符合预期（图1.1C）；随后将这8个阳性菌落扩大培养后再次进行PCR，结果与菌落PCR一致，（由于目的片段未经PCR，故不需要进行测序验证）以上结果表明成功构建出含有S1PR3siRNA片段的重组逆转录病毒质粒。图1.1敲低S1PR3重组质粒的构建敲低S1PR3重组质粒示意图；B.SEB361质粒酶切后片段；C.质粒PCR鉴定Fig.1.1ConstructionoftheknockingdownS1PR3ofrecombinedplasmidTheknockingdownS1PR3ofrecombinedplasmid;B.SEB361afterenzymecleavage;C.TheresultsofPCRidentifiedrecombined.2.2构建稳定敲低S1PR3表达的T-ALL细胞系（Jurkat、Cutll1和Molt4细胞）5"LTRBSDU6siRNAH1U6H1U6H13"LTRAC12345678920001000750500100250bp123bpB100007000400010002000100500
重庆医科大学硕士研究生学位论文22利用S1PR3基因siRNA病毒及对照空载逆转录病毒感染T-ALL细胞系（Jurkat、Cutll1和Molt-4细胞），并将敲低S1PR3表达的Jurkat、Cutll1和Molt-4细胞分别命名为Jurkatsi、Cutll1si和Molt-4si。经Blasticidin药筛后，利用q-PCR检测其S1PR3mRNA和蛋白表达水平。q-PCR结果显示，Jurkatsi细胞S1PR3mRNA表达水平降低至对照细胞的40.2%（p<0.01）；Cutll1si细胞S1PR3mRNA表达水平降低至对照细胞的45.1%（p<0.01）；Molt-4si细胞S1PR3mRNA表达降低至对照细胞的30.4%（p<0.01）（图2.2A）。利用Westernblot检测其S1PR3蛋白表达水平。Westernblot结果显示，Jurkatsi细胞S1PR3蛋白表达降低至对照细胞的47.6%（p<0.05）；Cutll1si细胞S1PR3蛋白表达降低至对照细胞的57.1%（p<0.05）；Molt-4si细胞S1PR3蛋白表达降低至对照细胞的34.0%（p<0.05）（图2.2B）。上述结果表明，成功构建了稳定敲低S1PR3的T-ALL细胞系（Jurkat、Cutll1和Molt-4细胞）。图1.2稳定敲低S1PR3的T-ALL细胞系鉴定A.q-PCR检测T-ALL细胞S1PR3mRNA表达；B.WB检测T-ALL细胞S1PR3蛋白表达;Fig.1.2IdentificationofknockingdownS1PR3stableT-ALLcellsA.mRNAexpressionofS1PR3inT-ALLcells;B.proteinexpressionofS1PR3T-ALLcells
本文编号：2990560
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
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【学位级别】：硕士
【部分图文】：
敲低S1PR3重组质粒的构建100100
重庆医科大学硕士研究生学位论文21以SEB-361逆转录病毒载体为骨架，设计针对S1PR3基因的序列（图1.1A）。通过华大基因公司合成目的片段，进行基因克隆（图1.1B），构建敲低S1PR3重组逆转录病毒质粒。挑取平板中的菌落进行PCR，在挑取的20个菌落中有8个产物经琼脂糖凝胶电泳后在501bp处有一条明亮的单一条带，产物大小符合预期（图1.1C）；随后将这8个阳性菌落扩大培养后再次进行PCR，结果与菌落PCR一致，（由于目的片段未经PCR，故不需要进行测序验证）以上结果表明成功构建出含有S1PR3siRNA片段的重组逆转录病毒质粒。图1.1敲低S1PR3重组质粒的构建敲低S1PR3重组质粒示意图；B.SEB361质粒酶切后片段；C.质粒PCR鉴定Fig.1.1ConstructionoftheknockingdownS1PR3ofrecombinedplasmidTheknockingdownS1PR3ofrecombinedplasmid;B.SEB361afterenzymecleavage;C.TheresultsofPCRidentifiedrecombined.2.2构建稳定敲低S1PR3表达的T-ALL细胞系（Jurkat、Cutll1和Molt4细胞）5"LTRBSDU6siRNAH1U6H1U6H13"LTRAC12345678920001000750500100250bp123bpB100007000400010002000100500
重庆医科大学硕士研究生学位论文22利用S1PR3基因siRNA病毒及对照空载逆转录病毒感染T-ALL细胞系（Jurkat、Cutll1和Molt-4细胞），并将敲低S1PR3表达的Jurkat、Cutll1和Molt-4细胞分别命名为Jurkatsi、Cutll1si和Molt-4si。经Blasticidin药筛后，利用q-PCR检测其S1PR3mRNA和蛋白表达水平。q-PCR结果显示，Jurkatsi细胞S1PR3mRNA表达水平降低至对照细胞的40.2%（p<0.01）；Cutll1si细胞S1PR3mRNA表达水平降低至对照细胞的45.1%（p<0.01）；Molt-4si细胞S1PR3mRNA表达降低至对照细胞的30.4%（p<0.01）（图2.2A）。利用Westernblot检测其S1PR3蛋白表达水平。Westernblot结果显示，Jurkatsi细胞S1PR3蛋白表达降低至对照细胞的47.6%（p<0.05）；Cutll1si细胞S1PR3蛋白表达降低至对照细胞的57.1%（p<0.05）；Molt-4si细胞S1PR3蛋白表达降低至对照细胞的34.0%（p<0.05）（图2.2B）。上述结果表明，成功构建了稳定敲低S1PR3的T-ALL细胞系（Jurkat、Cutll1和Molt-4细胞）。图1.2稳定敲低S1PR3的T-ALL细胞系鉴定A.q-PCR检测T-ALL细胞S1PR3mRNA表达；B.WB检测T-ALL细胞S1PR3蛋白表达;Fig.1.2IdentificationofknockingdownS1PR3stableT-ALLcellsA.mRNAexpressionofS1PR3inT-ALLcells;B.proteinexpressionofS1PR3T-ALLcells
本文编号：2990560
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