新型脂肪细胞因子网膜素核心启动子区转录因子的筛选及验证

发布时间：2021-01-22 17:45

　　背景:网膜素是一种新型脂肪因子,也被称为肠凝集素-1（Intelectin-1,ITLN-1）。ITLN-1不仅与肥胖症、糖尿病等疾病关系密切,其在抗炎症、抗动脉粥样硬化、抑制肿瘤细胞增殖中的突出作用也得到众多科研工作者的关注。有研究表明缺血性脑卒中稳定斑块组患者血清的ITLN-1水平高于不稳定颈动脉斑块组。不同个体间的ITLN-1水平具有着明显差异。ITLN-1在人内皮细胞、网织红细胞以及结肠、卵巢、肺和胎盘等组织中均有不同程度的表达,但在皮下脂肪中检测不到。因此研究人ITLN-1基因的转录调控机制将有重要的研究意义。DNA pull down是一种基于DNA短片段拥有对DNA结合蛋白的高亲和力位点并借助生物素/链霉亲和素纯化系统开发出的一种技术,广泛应用于DNA-蛋白质相互作用的研究中。目的:为进一步探索ITLN-1在表达过程中受到的转录调控机制,我们使用前期实验确定出的ITLN-1核心启动子区序列为DNA探针进行DNA pull down实验。对结合在该序列的蛋白质进行富集,结合生信分析筛选出转录因子,通过小干扰RNA和双荧光素酶报告基因实验初步确定出该转录因子对ITLN-1表达... 

【文章来源】： 牛晓晨 延安大学

【文章页数】：54 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

（1）（2）琼脂糖凝胶电泳对目的探针进行分离、纯化并回收FIG.3-1（1）（2）Separation,purificationandrecoveryofthetargetprobebyagarosegelelectrophoresis

-23-（2）图3-1（1）（2）琼脂糖凝胶电泳对目的探针进行分离、纯化并回收FIG.3-1（1）（2）Separation,purificationandrecoveryofthetargetprobebyagarosegelelectrophoresis注：纯化biotin(0/+296)即对琼脂糖凝胶中ITLN-1核心启动子区序列经纯化、回收后得到的目的探针。图3-2通过WB检测HEK293细胞核提取物纯度Figure3-2DetectionofHEK293nuclearextractpuritybyWB注：GAPDH（37kDa）为胞浆蛋白内参;H3，histone（17kDa）核蛋白内参

-24-3.1.2pulldown根据DNAPull-down试剂盒说明书操作，将目的探针和阴性探针分别与核蛋白孵育，下拉，对下拉产物进行PAGE-银染，银染结果如图3-3（1）所示。在70kDa、100kDa、130kDa处实验组（DPD1、DPD2）条带颜色均明显较对照组（NC1、NC2）深，其余条带则无明显差异。分别将对照组及实验组在70kDa、100kDa、130kDa处的条带切胶送质谱检测，如图3-3（2）所示。（1）（2）图3-3（1）（2）DNApulldown产物SDS-PAGE后银染Figure3-3（1）（2）SilverstainingafterSDS-PAGEofDNApulldownproduct注：Marker为蛋白质分子量标准；NC1为使用阴性探针（NC探针）下拉产物，NC2为其复孔；DPD1为使用目的探针（DPD探针）下拉产物，DPD2为其复孔；Input为HEK293细胞核提取物。N1、N2、N3、D1、D2、D3为NC探针与DPD探针分别下拉产物出现的差异性条带。

【参考文献】：
期刊论文
[1]Role of hepatocyte nuclear factor 4-alpha in gastrointestinal and liver diseases[J]. Matthew M Yeh,Dustin E Bosch,Sayed S Daoud.  World Journal of Gastroenterology. 2019(30)



本文编号：2993649