基因治疗制剂TPKH和TPIN的初步安全性评价及其免疫作用探讨
发布时间：2021-02-17 09:45
目的（1）通过BALB/c小鼠急性毒性实验、一般药理学实验、基因表达蛋白分布实验,Wistar大鼠长期毒性实验,初步评价携带KGF和HIF-1ɑ双基因的减毒沙门氏菌TPKH以及携带NK4和IL-2双基因的减毒沙门氏菌TPIN的安全性。（2）探讨携带双基因的减毒沙门氏菌TPKH及TPIN对小鼠细胞免疫和小肠黏膜免疫的影响。方法（1）TPKH及TPIN小鼠急性毒性实验。不同剂量(1.0×108、1.0×109、1.0×1010cfu/0.1mL·只)TPKH或TPIN灌胃后观察对小鼠精神状态、体重的影响;灌胃后第14天进行血常规、肝功肾功指标及脏器指数的检测,并取对照组和高剂量灌胃组小鼠(1.0×1010cfu/0.1mL·只)心、肝、脾、肺、肾及胃肠组织,制作病理切片,观察各脏器组织形态。（2）TPKH及TPIN一般药理学实验。不同剂量（1.0×107、1.0×108、1.0×109cfu/0.1mL·只）TPKH或TPIN灌胃后观察对...
【文章来源】：甘肃中医药大学甘肃省
【文章页数】：102 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
TPKH对小鼠各脏器的影响（100×）
基因治疗制剂TPKH和TPIN的初步安全性评价及其免疫作用探讨19图1-2TPIN对小鼠各脏器的影响（100×）注：1~7分别为心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、肠；A为对照组，B为高剂量组。4讨论急性毒性实验是指机体24小时内一次或多次染毒的实验，是药物临床前毒理学研究的第一步，为临床安全用药提供一定的参考[48]。依据《生物技术药物安全性评价》中基因治疗药物非临床安全性评价的有关要求，急性毒性实验给药剂量的选择应包括无明显毒性反应剂量，观察到明显毒性的剂量以及中间剂量，当药物毒性较低时，可给予最大可能获得的剂量作为高剂量[47]。在课题组前期药效学实验中得到TPKH及TPIN的有效剂量为1.0×107~1.0×109cfu/只，因此在本实验中，以1.0×108cfu/0.1mL·只的剂量作为无明显毒性反应的剂量。因TPKH及TPIN的毒性较低，无法获得出现明显毒性的剂量，在预实验中，用1.0×1010cfu/0.1mL·只的剂量灌胃小鼠，在此剂量下小鼠无死亡，无明显毒性反应，且此剂量是在本实验室条件下容易获得的最大剂量，故本实验将高剂量组（1.0×1010cfu/0.1mL·只）作为急性毒性实验的最大给药量。在观察期间中，除由于药物进入肺部，导致个别小鼠死亡外，在之后的观察过程中未出现小鼠死亡现象。灌胃后
基因治疗制剂TPKH和TPIN的初步安全性评价及其免疫作用探讨30图3-1KGF标准曲线3.1.1.2各组织中KGF表达水平TPKH灌胃后各组织中KGF表达水平如表3-1所示：胃组织中的表达情况为在灌胃后的12、24、48、72、96小时，显著表达（P<0.05）；小肠组织中的表达情况为在灌胃后的12、24小时，极显著表达（P<0.01），在灌胃后的48、72、96小时，显著表达（P<0.05）；在心脏、肝脏、脾脏等其他组织内表达不显著（P>0.05）。表3-1各组织中KGF表达水平（ng/mL,x±s,n=4）0h12h24h48h72h96h心脏1.58±0.121.60±0.261.31±0.171.53±0.231.26±0.031.23±0.12肝脏1.40±0.101.60±0.211.38±0.141.54±0.291.29±0.081.36±0.03脾脏1.18±0.061.20±0.041.19±0.071.37±0.131.19±0.151.07±0.05肺脏1.42±0.191.32±0.141.34±0.171.59±0.231.43±0.061.37±0.91肾脏1.68±0.041.60±0.121.72±0.201.65±0.131.60±0.301.47±0.16胃1.56±0.091.90±0.23*1.90±0.05*1.81±0.14*1.83±0.11*1.87±0.06*小肠1.49±0.082.01±0.19**1.97±0.11**1.95±0.16**1.89±0.06**1.78±0.12*肌肉1.28±0.171.25±0.031.51±0.141.27±0.101.06±0.041.20±0.13脑1.27±0.061.33±0.141.54±0.221.42±0.181.32±0.041.24±0.09*与对照组相比，P<0.05，差异显著；**与对照组相比，P<0.01，差异极显著。3.1.2HIF-1ɑ基因表达蛋白水平3.1.2.1HIF-1ɑ标准曲线根据HIF-1ɑELISA试剂盒中提供的6个不同浓度的标准品，以HIF-1ɑ浓度为横坐标，OD450nm吸光度值为纵坐标绘制HIF-1ɑ标准曲线，结果如图3-2所示。其线性回归方程为y=0.0165x+0.1057，相关系数R值为0.9571，大于0.95，具有可行度和线性关
【参考文献】：
期刊论文
[1]中草药复合添加剂的小鼠急性毒性试验[J]. 崔耀成,买占海,库莱夏·阿力别克,王德超,沙娅·奴尔兰,张敖云图雅,况玲. 中国畜牧兽医. 2018(12)
[2]携带低氧诱导因子-1α及角质细胞生长因子的减毒沙门菌TPHK的构建及其在低氧应激大鼠胃肠组织中的表达[J]. 白燕青,徐倩,曾通旭,曹荟哲,哈小琴. 中国生物制品学杂志. 2017(02)
[3]口服重组减毒沙门菌TPIN抗小鼠黑色素瘤研究[J]. 哈小琴,张尚弟,杨志华,孙琳,郭馨云,彭俊华,董菊子,张媛媛. 解放军医药杂志. 2014(07)
[4]携带IL-2和NK4双基因真核共表达载体的减毒沙门菌株的构建[J]. 张尚弟,哈小琴,杨志华,李兵,邓芝云,姜东红,张俊,王剑锋. 解放军医药杂志. 2014(07)
[5]TPIN对HepG2肝癌细胞生物学特性的影响[J]. 樊红艳,哈小琴,张尚弟,杨志华,宋月娟,李晓云,刘延彤,徐越斌,林静. 解放军医药杂志. 2014(07)
[6]低氧诱导因子-1α和角质细胞生长因子双基因重组减毒沙门菌菌株的构建及其在肠上皮细胞中的表达[J]. 哈小琴,李晓云,邓芝云,董菊子,赵勇,王鲲,张媛媛,张俊,杨志华. 解放军医药杂志. 2013(11)
[7]High-altitude gastrointestinal bleeding:An observation in Qinghai-Tibetan railroad construction workers on Mountain Tanggula[J]. Tian-Yi Wu, Physiological Research Group of Ministry of Railway, PRC, High Altitude Medical Research Institute, Xining 810012, Qinghai Province, ChinaShou-Quan Ding, 12th Hospital of Qinghai-Tibetan Railroad Construction Company, Golmud 816000, Qinghai Province, ChinaJin-Liang Liu, Jian-Hou Jia, 20th Hospital of Qinghi-Tibetan Railroad Construction Company, Golmud 816000, Qinghai Province, ChinaRui-Chen Dai, Dong-Chun Zhu, Public Health Bureau of Qinghai-Tibetan Railroad Construction Company, Golmud 816000, Qinghai Province, ChinaBao-Zhu Liang, De-Tang Qi, China Railroad Construction Company, Beijing 100844, ChinaYong-Fu Sun, Ministry of Railway, Beijing 100844, China. World Journal of Gastroenterology. 2007(05)
[8]中药新药一般药理学研究技术要求和常见问题分析[J]. 黄芳华. 中国中药杂志. 2007(01)
硕士论文
[1]TPHK对应激致大鼠肠黏膜损伤的防护作用初探[D]. 杨志华.甘肃农业大学 2012
本文编号：3037805
【文章来源】：甘肃中医药大学甘肃省
【文章页数】：102 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
TPKH对小鼠各脏器的影响（100×）
基因治疗制剂TPKH和TPIN的初步安全性评价及其免疫作用探讨19图1-2TPIN对小鼠各脏器的影响（100×）注：1~7分别为心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、肠；A为对照组，B为高剂量组。4讨论急性毒性实验是指机体24小时内一次或多次染毒的实验，是药物临床前毒理学研究的第一步，为临床安全用药提供一定的参考[48]。依据《生物技术药物安全性评价》中基因治疗药物非临床安全性评价的有关要求，急性毒性实验给药剂量的选择应包括无明显毒性反应剂量，观察到明显毒性的剂量以及中间剂量，当药物毒性较低时，可给予最大可能获得的剂量作为高剂量[47]。在课题组前期药效学实验中得到TPKH及TPIN的有效剂量为1.0×107~1.0×109cfu/只，因此在本实验中，以1.0×108cfu/0.1mL·只的剂量作为无明显毒性反应的剂量。因TPKH及TPIN的毒性较低，无法获得出现明显毒性的剂量，在预实验中，用1.0×1010cfu/0.1mL·只的剂量灌胃小鼠，在此剂量下小鼠无死亡，无明显毒性反应，且此剂量是在本实验室条件下容易获得的最大剂量，故本实验将高剂量组（1.0×1010cfu/0.1mL·只）作为急性毒性实验的最大给药量。在观察期间中，除由于药物进入肺部，导致个别小鼠死亡外，在之后的观察过程中未出现小鼠死亡现象。灌胃后
基因治疗制剂TPKH和TPIN的初步安全性评价及其免疫作用探讨30图3-1KGF标准曲线3.1.1.2各组织中KGF表达水平TPKH灌胃后各组织中KGF表达水平如表3-1所示：胃组织中的表达情况为在灌胃后的12、24、48、72、96小时，显著表达（P<0.05）；小肠组织中的表达情况为在灌胃后的12、24小时，极显著表达（P<0.01），在灌胃后的48、72、96小时，显著表达（P<0.05）；在心脏、肝脏、脾脏等其他组织内表达不显著（P>0.05）。表3-1各组织中KGF表达水平（ng/mL,x±s,n=4）0h12h24h48h72h96h心脏1.58±0.121.60±0.261.31±0.171.53±0.231.26±0.031.23±0.12肝脏1.40±0.101.60±0.211.38±0.141.54±0.291.29±0.081.36±0.03脾脏1.18±0.061.20±0.041.19±0.071.37±0.131.19±0.151.07±0.05肺脏1.42±0.191.32±0.141.34±0.171.59±0.231.43±0.061.37±0.91肾脏1.68±0.041.60±0.121.72±0.201.65±0.131.60±0.301.47±0.16胃1.56±0.091.90±0.23*1.90±0.05*1.81±0.14*1.83±0.11*1.87±0.06*小肠1.49±0.082.01±0.19**1.97±0.11**1.95±0.16**1.89±0.06**1.78±0.12*肌肉1.28±0.171.25±0.031.51±0.141.27±0.101.06±0.041.20±0.13脑1.27±0.061.33±0.141.54±0.221.42±0.181.32±0.041.24±0.09*与对照组相比，P<0.05，差异显著；**与对照组相比，P<0.01，差异极显著。3.1.2HIF-1ɑ基因表达蛋白水平3.1.2.1HIF-1ɑ标准曲线根据HIF-1ɑELISA试剂盒中提供的6个不同浓度的标准品，以HIF-1ɑ浓度为横坐标，OD450nm吸光度值为纵坐标绘制HIF-1ɑ标准曲线，结果如图3-2所示。其线性回归方程为y=0.0165x+0.1057，相关系数R值为0.9571，大于0.95，具有可行度和线性关
【参考文献】：
期刊论文
[1]中草药复合添加剂的小鼠急性毒性试验[J]. 崔耀成,买占海,库莱夏·阿力别克,王德超,沙娅·奴尔兰,张敖云图雅,况玲. 中国畜牧兽医. 2018(12)
[2]携带低氧诱导因子-1α及角质细胞生长因子的减毒沙门菌TPHK的构建及其在低氧应激大鼠胃肠组织中的表达[J]. 白燕青,徐倩,曾通旭,曹荟哲,哈小琴. 中国生物制品学杂志. 2017(02)
[3]口服重组减毒沙门菌TPIN抗小鼠黑色素瘤研究[J]. 哈小琴,张尚弟,杨志华,孙琳,郭馨云,彭俊华,董菊子,张媛媛. 解放军医药杂志. 2014(07)
[4]携带IL-2和NK4双基因真核共表达载体的减毒沙门菌株的构建[J]. 张尚弟,哈小琴,杨志华,李兵,邓芝云,姜东红,张俊,王剑锋. 解放军医药杂志. 2014(07)
[5]TPIN对HepG2肝癌细胞生物学特性的影响[J]. 樊红艳,哈小琴,张尚弟,杨志华,宋月娟,李晓云,刘延彤,徐越斌,林静. 解放军医药杂志. 2014(07)
[6]低氧诱导因子-1α和角质细胞生长因子双基因重组减毒沙门菌菌株的构建及其在肠上皮细胞中的表达[J]. 哈小琴,李晓云,邓芝云,董菊子,赵勇,王鲲,张媛媛,张俊,杨志华. 解放军医药杂志. 2013(11)
[7]High-altitude gastrointestinal bleeding:An observation in Qinghai-Tibetan railroad construction workers on Mountain Tanggula[J]. Tian-Yi Wu, Physiological Research Group of Ministry of Railway, PRC, High Altitude Medical Research Institute, Xining 810012, Qinghai Province, ChinaShou-Quan Ding, 12th Hospital of Qinghai-Tibetan Railroad Construction Company, Golmud 816000, Qinghai Province, ChinaJin-Liang Liu, Jian-Hou Jia, 20th Hospital of Qinghi-Tibetan Railroad Construction Company, Golmud 816000, Qinghai Province, ChinaRui-Chen Dai, Dong-Chun Zhu, Public Health Bureau of Qinghai-Tibetan Railroad Construction Company, Golmud 816000, Qinghai Province, ChinaBao-Zhu Liang, De-Tang Qi, China Railroad Construction Company, Beijing 100844, ChinaYong-Fu Sun, Ministry of Railway, Beijing 100844, China. World Journal of Gastroenterology. 2007(05)
[8]中药新药一般药理学研究技术要求和常见问题分析[J]. 黄芳华. 中国中药杂志. 2007(01)
硕士论文
[1]TPHK对应激致大鼠肠黏膜损伤的防护作用初探[D]. 杨志华.甘肃农业大学 2012
本文编号：3037805
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