α-螺旋抗癌肽L-K6对人乳腺癌MCF-7细胞的内化机制研究

发布时间：2017-04-18 20:21

  本文关键词：α-螺旋抗癌肽L-K6对人乳腺癌MCF-7细胞的内化机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：L-K6是中国林蛙皮肤抗菌肽Temporin-1CEb的改造肽。本实验室前期研究表明,L-K6对多种乳腺癌细胞的增殖有显著的抑制作用。跨膜电位检测显示L-K6对乳腺癌MCF-7的细胞膜无明显的去极化作用,对细胞膜通透性影响较小并且对细胞膜没有明显的破坏作用。这些结果提示L-K6对乳腺癌MCF-7细胞的作用靶点可能是胞内物质而非细胞膜。本论文初步探究L-K6进入细胞膜方式及作用机制。首先,我们利用激光共聚焦显微镜和超高分辨率显微镜研究L-K6对乳腺癌MCF-7细胞的细胞膜、细胞骨架、细胞核形态结构的影响,结果显示L-K6作用1小时,MCF-7细胞膜基本保持完整,细胞骨架形态清晰,但是细胞核荧光减弱,并随L-K6浓度增大核荧光减弱程度增加。说明L-K6以某种方式进入细胞后,作用于细胞核。其次,我们利用流式细胞仪、荧光酶标仪、超高分辨率显微镜研究L-K6的入膜方式。检测结果显示,用内吞抑制剂甲基-β-环糊精(M-β-CD)、阿米洛利(EIPA)、氯丙嗪(CPZ)、细胞松弛素D(CyD)处理细胞后,FITC-L-K6的内化量均有不同程度的减少,证明L-K6主要以内吞的方式进入MCF-7细胞,其中细胞松弛素D(CyD)对L-K6内化量的影响最为显著。为探究L-K6内化过程的能量依赖性,我们进行了低温试验,实验结果显示,在4oC低温环境中L-K6的内化量与37oC环境中L-K6的内化量相比显著降低,说明L-K6的内化具有能量依赖性。L-K6是阳离子抗菌肽,其首先通过静电作用与MCF-7细胞表面带负电荷的磷脂酰丝氨酸(PS)结合,聚集在MCF-7细胞表面,达到内吞作用的启动。等温滴定微量热仪(ITC)实验证明了L-K6与PS发生特异性结合,结合比接近1:1;CD色谱实验也证明PS可以诱导L-K6形成α-螺旋结构,并随着PS浓度增加,L-K6形成α-螺旋含量增加。而MCF-7细胞膜表面带负电荷的HS、CS和神经节苷脂不参与L-K6的内化。
【关键词】：抗癌肽 抗癌活性 内吞作用 磷脂酰丝氨酸
【学位授予单位】：辽宁师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R73-36;Q51
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 引言8-9
• 1.文献综述9-16
• 1.1 抗菌肽的研究概况9-10
• 1.1.1 抗菌肽来源9
• 1.1.2 抗菌肽的分类9-10
• 1.1.3 抗菌肽的生物活性10
• 1.1.4 抗癌肽10
• 1.2 抗癌肽的作用机制10-15
• 1.2.1 抗癌肽的抗癌活性作用机制10-13
• 1.2.2 抗癌肽的内化机制及影响因素13-15
• 1.3 抗癌肽的应用前景15-16
• 2.L-K6对细胞结构的影响16-21
• 2.1 材料16
• 2.1.1 实验材料16
• 2.1.2 分析工具16
• 2.2 实验方法16-17
• 2.2.1 细胞培养16
• 2.2.2 激光共聚焦显微镜观察L-K6对细胞膜的影响16-17
• 2.2.3 超高分辨率显微镜观察L-K6对细胞骨架和细胞核的影响17
• 2.3 实验结果17-19
• 2.3.1 L-K6对细胞膜的影响17-18
• 2.3.2 L-K6对细胞骨架和细胞核的影响18-19
• 2.4 讨论19-21
• 3.L-K6的内化机制--内吞作用方式的探究21-31
• 3.1 材料21
• 3.1.1 实验材料21
• 3.1.2 分析工具21
• 3.2 实验方法21-22
• 3.2.1MTT法检测四种内吞抑制剂对L-K6细胞毒的影响21
• 3.2.2 荧光酶标仪和流式细胞仪检测四种内吞抑制剂对L-K6内化的影响21-22
• 3.2.3 超高分辨显微镜检测四种抑制剂对L-K6内化影响22
• 3.2.4 低温检测L-K6的内化与能量的关系22
• 3.3 实验结果22-29
• 3.3.1 四种内吞抑制剂对L-K6细胞毒的影响22-23
• 3.3.2 四种内吞抑制剂对L-K6内化的影响23-27
• 3.3.3 L-K6内化的能量依赖性27-29
• 3.4 讨论29-31
• 4.细胞表面负电荷成分对L-K6内化的影响31-37
• 4.1 材料31
• 4.1.1 实验材料31
• 4.1.2 分析仪器31
• 4.2 实验方法31-32
• 4.2.1 ITC方法检测PS与L-K6的结合31
• 4.2.2 圆二色谱检测L-K6在不同的脂质体环境中的二级结构变化31
• 4.2.3 MTT检测HS、CS、GM1对L-K6细胞毒的影响31-32
• 4.3 实验结果32-34
• 4.3.1 磷脂酰丝氨酸（PS）与L-K6的结合32
• 4.3.2 L-K6在不同PS含量的脂质体环境中二级结构的变化32-34
• 4.3.3 HS、CS、GM1对L-K6细胞毒的影响34
• 4.4 讨论34-37
• 结论37-38
• 参考文献38-41
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况41-42
• 致谢42

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本文编号：315684