两种遗传代谢病新突变的鉴定及致病机制研究
发布时间：2021-05-17 08:16
遗传代谢病是一种先天的、遗传代谢功能障碍的一类疾病。多数是因为维持机体正常代谢的酶或受体的编码基因出现了异常而引发的一系列单基因遗传病。Reed综合征,是一种罕见的常染体显性遗传病,患者往往患有皮肤平滑肌瘤,而且患者患肾癌的风险远远高于常人。FH基因在Reed综合征中起着重要的作用。本研究在患有Reed综合征子宫平滑肌瘤的家系中鉴定出新发的FH突变c.557 G>A（p.S186N）,并且进行了一系列研究以确认该突变的致病性。对于该病的研究,我们首先利用Sanger测序技术对Reed综合征先证者血液进行了测序分析,发现并验证了该患者携带FH c.557G>A突变,并且该突变点尚未报道,因此本研究将围绕FH c.557G>A突变的致病机制展开研究。利用生物信息学、生物化学和细胞生物学的方法对突变体蛋白的结构和功能进行分析;通过构建pEGFP-FH-WT和pEGFP-FH-MT的真核表达载体,转染细胞,利用免疫荧光技术检测FH c.557G>A突变体蛋白在细胞中的定位是否发生变化;通过细胞增殖实验检测FH c.557G>A突变体对细胞增殖速度的影响;通过构建稳...
【文章来源】：山西大学山西省
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 遗传代谢病
1.2 Reed综合征
1.2.1 概述
1.2.2 临床症状
1.2.3 研究现状
1.2.4 富马酸水合酶(FH)
1.2.5 FH基因突变
1.3 先天性去糖基化障碍(NGLY1-CDDG)
1.3.1 概述
1.3.2 临床症状
1.3.3 研究现状
1.3.4 N-聚糖酶(NGLY1)
1.4 本研究的目的及意义
第二章 Reed综合征相关基因FH新突变位点c.G557A的鉴定及致病机制研究
2.1 引言
2.2 研究对象与材料
2.2.1 研究对象
2.2.2 实验试剂
2.2.3 仪器设备
2.3 实验方法
2.3.1 血液基因组DNA的提取
2.3.2 利用Sanger测序技术验证FH突变位点
2.3.3 FH突变位点的序列保守性及三级结构建模分析
2.3.4 免疫荧光检测突变蛋白在细胞中的定位
2.3.5 FH四聚体结构的检测
2.3.6 FH富马酸酶活性的测定
2.3.7 cck8 检测细胞增殖
2.3.8 使用Seahorse XF24 通量分析仪测量稳定细胞系的细胞外酸化率
2.3.9 Western Blot
2.4 实验结果
2.4.1 患者信息及测序结果
A 突变导致酶活性降低"> 2.4.2 FH c.557G>A 突变导致酶活性降低
2.4.3 富马酸水合酶四聚体的异常及FH突变体在转染细胞中的定位
2.4.4 FH突变体引起细胞表型发生改变
2.4.5 FH突变体引起mTOR信号转导和自噬失调
2.5 讨论与分析
第三章 去糖基化疾病相关基因NGLY1 新突变位点的鉴定和致病机制研究
3.1 引言
3.2 研究对象与材料
3.2.1 研究对象
3.2.2 实验试剂
3.2.3 仪器设备
3.3 实验方法
3.3.1 血液基因组DNA的提取
3.3.2 利用全外显子和Sanger测序技术鉴定NGLY1 突变位点
3.3.3 免疫荧光检测突变蛋白在细胞中的定位
3.3.4 NGLY1 野生型与突变体表达载体的构建
3.3.5 敲低NGLY1 的慢病毒载体的构建及稳定细胞株的筛选
3.3.6 Western Blot检测稳定敲低NGLY1 的细胞株
3.3.7 NGLY1 过表达载体的构建
3.3.8 免疫共沉淀(IP)
3.4 实验结果
A(p.R411X)和c.1405G>A(p.R469 X)的鉴定及验证"> 3.4.1 NGLY1 新突变位点c.1231G>A(p.R411X)和c.1405G>A(p.R469 X)的鉴定及验证
3.4.2 NGLY1 基因突变对蛋白质在细胞内定位的影响
3.4.3 NGLY1 过表达载体的构建和稳定敲低细胞系的筛选及验证
3.4.4 与NGLY1 相互作用的蛋白的鉴定
3.5 讨论与分析
第四章 斑马鱼Ngly1 的生物学特性及克隆表达研究
4.1 引言
4.2 实验材料与仪器
4.2.1 实验动物
4.2.2 实验试剂
4.2.3 仪器设备
4.3 实验方法
4.3.1 分子克隆和质粒构建
4.3.2 斑马鱼的解剖
4.3.3 RT-PCR和 qRT-PCR
4.3.4 细胞培养
4.3.5 生物信息学分析
4.4 实验结果
4.4.1 生物信息学分析
4.4.2 斑马鱼ngly1 的克隆与表达
4.4.3 ngly1 的组织特异性表达
4.4.4 胚胎发生过程中ngly1 的时空表达
4.5 讨论与分析
总结与展望
1 总结
2 展望
参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人情况及联系方式
本文编号：3191428
【文章来源】：山西大学山西省
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 遗传代谢病
1.2 Reed综合征
1.2.1 概述
1.2.2 临床症状
1.2.3 研究现状
1.2.4 富马酸水合酶(FH)
1.2.5 FH基因突变
1.3 先天性去糖基化障碍(NGLY1-CDDG)
1.3.1 概述
1.3.2 临床症状
1.3.3 研究现状
1.3.4 N-聚糖酶(NGLY1)
1.4 本研究的目的及意义
第二章 Reed综合征相关基因FH新突变位点c.G557A的鉴定及致病机制研究
2.1 引言
2.2 研究对象与材料
2.2.1 研究对象
2.2.2 实验试剂
2.2.3 仪器设备
2.3 实验方法
2.3.1 血液基因组DNA的提取
2.3.2 利用Sanger测序技术验证FH突变位点
2.3.3 FH突变位点的序列保守性及三级结构建模分析
2.3.4 免疫荧光检测突变蛋白在细胞中的定位
2.3.5 FH四聚体结构的检测
2.3.6 FH富马酸酶活性的测定
2.3.7 cck8 检测细胞增殖
2.3.8 使用Seahorse XF24 通量分析仪测量稳定细胞系的细胞外酸化率
2.3.9 Western Blot
2.4 实验结果
2.4.1 患者信息及测序结果
A 突变导致酶活性降低"> 2.4.2 FH c.557G>A 突变导致酶活性降低
2.4.3 富马酸水合酶四聚体的异常及FH突变体在转染细胞中的定位
2.4.4 FH突变体引起细胞表型发生改变
2.4.5 FH突变体引起mTOR信号转导和自噬失调
2.5 讨论与分析
第三章 去糖基化疾病相关基因NGLY1 新突变位点的鉴定和致病机制研究
3.1 引言
3.2 研究对象与材料
3.2.1 研究对象
3.2.2 实验试剂
3.2.3 仪器设备
3.3 实验方法
3.3.1 血液基因组DNA的提取
3.3.2 利用全外显子和Sanger测序技术鉴定NGLY1 突变位点
3.3.3 免疫荧光检测突变蛋白在细胞中的定位
3.3.4 NGLY1 野生型与突变体表达载体的构建
3.3.5 敲低NGLY1 的慢病毒载体的构建及稳定细胞株的筛选
3.3.6 Western Blot检测稳定敲低NGLY1 的细胞株
3.3.7 NGLY1 过表达载体的构建
3.3.8 免疫共沉淀(IP)
3.4 实验结果
A(p.R411X)和c.1405G>A(p.R469 X)的鉴定及验证"> 3.4.1 NGLY1 新突变位点c.1231G>A(p.R411X)和c.1405G>A(p.R469 X)的鉴定及验证
3.4.2 NGLY1 基因突变对蛋白质在细胞内定位的影响
3.4.3 NGLY1 过表达载体的构建和稳定敲低细胞系的筛选及验证
3.4.4 与NGLY1 相互作用的蛋白的鉴定
3.5 讨论与分析
第四章 斑马鱼Ngly1 的生物学特性及克隆表达研究
4.1 引言
4.2 实验材料与仪器
4.2.1 实验动物
4.2.2 实验试剂
4.2.3 仪器设备
4.3 实验方法
4.3.1 分子克隆和质粒构建
4.3.2 斑马鱼的解剖
4.3.3 RT-PCR和 qRT-PCR
4.3.4 细胞培养
4.3.5 生物信息学分析
4.4 实验结果
4.4.1 生物信息学分析
4.4.2 斑马鱼ngly1 的克隆与表达
4.4.3 ngly1 的组织特异性表达
4.4.4 胚胎发生过程中ngly1 的时空表达
4.5 讨论与分析
总结与展望
1 总结
2 展望
参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人情况及联系方式
本文编号：3191428
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/mpalunwen/3191428.html
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