Fucoidan下调HIF-1α表达抑制淋巴管新生与Hca-F细胞侵袭转移能力的影响及机制研究

发布时间：2017-04-23 09:00

  本文关键词：Fucoidan下调HIF-1α表达抑制淋巴管新生与Hca-F细胞侵袭转移能力的影响及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:低氧是肿瘤微环境的重要特征之一。在低氧环境中,低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)促进肿瘤发展与演进。HIF-1α的合成与稳定性受氧浓度调控。在肿瘤内部呈现低氧的条件下,HIF-1α的两个脯氨酸残基被氧依赖的脯氨酸羟化酶羟基化的活性受到抑制,α亚基能稳定存在细胞胞浆中,泛素化降解途径受阻,并与核转录因子蛋白家族NF-κB协同作用,将α亚基转运至细胞核内,与结构性亚基HIF-1β形成稳定并且具有调控转录功能的二聚体,结合到特异的核苷酸序列,即缺氧反应元件(hypoxia responsive element,HRE)从而形成复合体,激活下游相关40多种基因的表达,调控血管、淋巴管的生成,能量的摄入,细胞的存活、增殖和侵袭转移等生物学行为,因此,靶向抗HIF-1α的蛋白合成,核转位及稳定性的药物研究,具有潜力,对肿瘤转移,易复发的治疗具有重大意义。肿瘤是严重威胁人类健康的杀手之一,其中,肝癌因预后易复发,易转移等特征成为致死率第三的癌症。褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan),主要存在于褐藻体内,是一种富含硫酸酯的水溶性硫酸化杂聚糖。由于海洋生物资源丰富,富含具有药用价值活性物质,开发海洋药物已经成为当今研究的热点,其中多糖类物质具有多种生物活性,并且毒副作用小,因此,对fucoidan的生物活性研究更具潜力。本实验以具有淋巴道高转移能力的小鼠肝癌Hca-F细胞为模型,研究低氧环境下抑制淋巴道转移的功能及机制研究是理想细胞株。但是,近年来fucoidan对低氧环境下,对肝癌细胞的淋巴道转移与肿瘤细胞内部淋巴管新生能力的影响少见文献报道。方法:1.本文以氯化钴(Carbonyl chloride,CoCl2)模拟实体肿瘤低氧微环境。本实验设常氧,低氧,低氧加fucoidan组(100-400 g/ml fucoidan),采用MTT法检测构建低氧环境的Co Cl2作用Hca-F细胞的最适时间及作用药物浓度。2.探究低氧条件下,fucoidan对小鼠肝癌Hca-F细胞生长、HIF-1α表达、淋巴管新生及侵袭转移能力的影响以及fucoidan的干预作用。首先,采用CCK-8法,研究fucoidan在低氧环境下对Hca-F细胞活力的抑制作用。其次,采用western bloting、q RT-PCR及IFA法,研究fucoidan对Hca-F细胞中HIF-1α的表达及转位的抑制作用,及其调控的下游基因,包括促进淋巴管新生的生长因子VEGF-C和肝细胞生长因子HGF及其受体VEGFR-3和C-Met的表达的影响。最后,采用Transwell实验,探究fucoidan对低氧诱导Hca-F细胞迁移和侵袭能力的影响,以及促进肿瘤淋巴道转移ECM降解相关的基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9和抑制剂TIMP-1的表达。3.探究低氧条件下,fucoidan抑制小鼠肝癌Hca-F细胞HIF-1α表达相关信号通路关键作用因子的表达的影响。采用western bloting、qRT-PCR及IFA实验,研究具有高淋巴道转移潜力的Hca-F细胞中HIF-1α合成的PI3K/AKT/mTOR信号通路的表达及fucoidan的干预作用。结果:1.实验结果表明:Co Cl2(100 mol/L)作用于Hca-F细胞24h,显著上调HIF-1α蛋白和mRNA的表达(P0.01),因此成功建立体外低氧微环境。2.Fucoidan在低氧环境下作用于Hca-F细胞24h,可以下调NF-κB、MMP-2、MMP-9的表达,上调TIMP-1的表达,同时,细胞迁移和侵袭能力亦下降。并且fucoidan作用于Hca-F细胞,下调VEGF-C和HGF的表达。同时,小鼠体内实验,通过免疫组化结果显示:肿瘤内部淋巴内皮细胞成管结构不完全,能力下降,小鼠体内肿瘤淋巴管数显著减少,存在结构缺陷等现象。小鼠内皮淋巴细胞mLEC体外成管实验,在低氧条件下,mLEC细胞成管能力增强,成管数量明显增多,在fucoidan的干预作用下,mLEC细胞成管能力降低,数量相对低氧对照组,明显减少。3.高淋巴道转移潜力的Hca-F细胞中HIF-1α合成的PI3K/AKT/mTOR信号通路中,功能活性的p-PI3K/p-AKT/p-mTOR在低氧环境下的相对表达量比常氧环境下明显升高,效果显著,在fucoidan的干预作用下,p-PI3K/p-AKT/p-mTOR信号通路钝化。结论:在低氧环境下,fucoidan显著抑制小鼠肝癌Hca-F细胞侵袭,淋巴管新生和淋巴道转移的潜能,可能与NF-κB和HIF-1α的表达下调,钝化PI3K/AKT/mTOR和ERK信号通路有关。
【关键词】：Fucoidan 淋巴管新生 HIF-1α 低氧 转移
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R73-37
【目录】：

• 中文摘要9-11
• 英文摘要11-14
• 第一部分 低氧对小鼠肝癌Hca-F细胞活力、HIF-1α 表达的影响及fucoidan干预的作用研究14-35
• 前言14-15
• 材料和方法15-25
• 1. 材料15-17
• 1.1 细胞系及实验动物15
• 1.2 主要实验仪器及器材15
• 1.3 主要实验试剂与药品15-16
• 1.4 主要实验试剂的配置16-17
• 2. 方法17-24
• 2.1 细胞培养17
• 2.2 低氧模型的建立17-18
• 2.3 CCK-8 法检测细胞活力18
• 2.4 Trypan blue检测细胞毒作用18
• 2.5 AnnexinⅤ FITC 流式双染检测细胞凋亡18
• 2.6 细胞核蛋白提取及定量18-19
• 2.7 WB检测蛋白表达19
• 2.8 免疫荧光检测蛋白表达19
• 2.9 酶联免疫吸附( Elisa)检测细胞分泌蛋白的表达19-20
• 2.10 核酸mRNA提取及定量20-21
• 2.11 反转录21-22
• 2.12 SYBR Green 染料法 q RT-PCR 步骤22
• 2.13 定量 PCR 步骤22-24
• 3 统计学分析24-25
• 结果25-31
• 1. 不同浓度 Co Cl2对 Hca-F 细胞生长的影响25
• 2. Fucoidan 对低氧条件下小鼠肝癌 Hca-F 细胞活力的影响25-26
• 3．Fucoidan对低氧条件下小鼠肝癌Hca-F细胞凋亡的影响26-27
• 4．Fucoidan 对 Co Cl2诱导的 Hca-F 细胞 HIF-1α 表达及转位的影响27-28
• 5．Fucoidan 对低氧诱导环境下 Hca-F 细胞 HGF 和 VEHG-C 表达的影响28-29
• 6．Fucoidan 对低氧诱导环境下 Hca-F 细胞 C-Met 和 VEHGR-3 表达的影响29-31
• 讨论31-33
• 参考文献33-35
• 第二部分 Fucoidan对低氧Hca-F细胞淋巴管新生及转移及侵袭能力的影响35-51
• 前言35-36
• 材料和方法36-40
• 1.材料36
• 1.1 细胞系及实验动物36
• 1.2 主要实验仪器及器材36
• 1.3 主要实验试剂与药品36
• 2.方法36-39
• 2.1 细胞培养36
• 2.2 建立小鼠体内肿瘤淋巴结转移模型及药物处理36-37
• 2.3 HE染色37
• 2.4 免疫组织化学染色步骤37
• 2.5 小鼠mLECs体外成管实验37
• 2.6 小鼠体外Transwell小室细胞侵袭实验37-38
• 2.7 Western Blotting实验38
• 2.8 免疫组织荧光实验38-39
• 3.统计学处理39-40
• 结果40-45
• 1.Fucoidan对小鼠体内肿瘤淋巴结转移能力的影响40-41
• 2.Fucoidan对小鼠体内肿瘤淋巴管新生的影响41-42
• 3.Fucoidan对mLEC成管能力的影响42
• 4. Fucoidan对小鼠体外转移及侵袭能力的影响42-43
• 5. Fucoidan抑制低氧诱导的Hca-F细胞中HIF-1α 表达的相关信号通路的影响43-45
• 讨论45-47
• 结论47-48
• 参考文献48-51
• 综述51-65
• 参考文献60-65
• 创新点65-66
• 攻读学位期间发表文章情况66-67
• 致谢67-68

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 杨之;顾浩平;张海明;苏明远;秦芳;刘学良;;吸烟对高原人适应低氧环境能力的影响[J];心肺血管学报;1986年01期

2 ;间断缓慢暴露于低氧环境对小鼠饲养行为的影响[J];高原医学杂志;1994年04期

3 高红,周晶萍,王象勇,李子安;高海拔低氧环境人血清酶与平原水平比较分析[J];临床荟萃;2004年06期

4 陈丽;高海拔低氧环境下银行职工心电图调查分析[J];职业与健康;2001年03期

5 敖强国;宋世涛;邹慧;;高原低压低氧环境对平原健康男青年血像和肾功能影响[J];中华保健医学杂志;2011年06期

6 张海红;;骨髓间充质干细胞受低氧环境的影响探讨[J];亚太传统医药;2012年10期

7 丁盛;低氧环境神经衰弱的治疗体会[J];西藏医药杂志;1991年03期

8 谢新民;文亚兰;;长期低氧环境暴露对认知功能影响[J];中国公共卫生;2008年07期

9 刘娟;罗二平;吴小明;谢康宁;汤池;李娜;闫一力;申广浩;;便携式富氧机在模拟低氧环境中对机体血气的影响[J];中国医学物理学杂志;2012年02期

10 石永杰;申广浩;谢康宁;孙涛;刘娟;罗二平;;模拟低氧环境中弥散富氧对大鼠行为学指标的影响[J];中国医学物理学杂志;2013年01期

中国重要会议论文全文数据库 前9条

1 李国建;朱能;;高温高湿低氧环境对人情绪的影响研究[A];全国暖通空调制冷2008年学术年会论文集[C];2008年

2 刘晓林;朱能;李国建;孙丽婧;;对高温高湿低氧环境的初步研究[A];全国暖通空调制冷2006年学术年会论文集[C];2006年

3 朱卫中;董建文;丁海雷;周兆年;;生长发育在间歇性低氧环境能增加大鼠心肌抗缺血能力[A];中国生理学会第六届应用生理学委员会全国学术会议论文摘要汇编[C];2003年

4 郭晶;孙芳云;王守宝;张敏;朱敏侠;宫丽丽;戎浩;刘晓利;袁东亚;刘青;尼玛次仁;方莲花;杜冠华;;高原低压低氧环境对大鼠血管反应性的影响[A];中国药理学会第十次全国学术会议专刊[C];2009年

5 于海源;刘赵淼;马重芳;;高温低氧环境下逆向式燃烧与同向式燃烧的比较分析[A];北京力学会第11届学术年会论文摘要集[C];2005年

6 张卉杰;吴昊;黎健冰;;呼吸肌训练对低氧环境下呼吸肌群疲劳的表面肌电研究[A];2011年中国生理学会运动生理学专业委员会会议暨“运动与骨骼肌”学术研讨会论文集[C];2011年

7 张宽;朱玲玲;范明;;间歇性低氧环境对幼年小鼠神经干细胞增殖的影响[A];Proceedings of the 8th Biennial Conference of the Chinese Society for Neuroscience[C];2009年

8 陈涛;孙茂;黎春;田文宇;孙建勇;王祥云;刘春立;;低氧环境对~(125)I在甘肃北山深部花岗岩中扩散行为的影响[A];中国化学会第26届学术年会现代核化学与放射化学分会场论文集[C];2008年

9 赵善民;晋玲;黄丽娟;何显教;黄俊杰;梁祚仁;黄彦峰;;心肌缺血在低温低氧环境下的心电图变化分析[A];中南地区第六届生理学学术会议论文摘要汇编[C];2004年

中国重要报纸全文数据库 前3条

1 胡德荣;低氧环境诱导急粒白血病细胞系分化[N];健康报;2006年

2 蔡申夫;青藏铁路：高海拔的考验[N];科技日报;2003年

3 安琪;沉着应对高原反应[N];医药养生保健报;2003年

中国博士学位论文全文数据库 前4条

1 王海涛;低氧环境模拟医学研究平台建立与应用研究[D];山东大学;2011年

2 李国建;高温高湿低氧环境下人体热耐受性研究[D];天津大学;2008年

3 沈凌;黄芪对低氧环境下血管内皮细胞生长因子/基质细胞衍生因子-1诱导人骨髓间充质干细胞分化、迁移的干预作用的研究[D];北京中医药大学;2010年

4 涂生芬;低氧环境下丙泊酚对新生大鼠学习记忆功能的影响及其机制研究[D];重庆医科大学;2011年

中国硕士学位论文全文数据库 前7条

1 王先;低氧环境对肥胖男青年最大脂代谢水平的影响[D];河北师范大学;2015年

2 滕洪明;Fucoidan下调HIF-1α表达抑制淋巴管新生与Hca-F细胞侵袭转移能力的影响及机制研究[D];大连医科大学;2015年

3 蔺瑞;低氧环境监测与控制系统的改进[D];河北工业大学;2006年

4 刘晓林;高温高湿低氧环境中影响人体耐力的若干因素实验研究[D];天津大学;2007年

5 张卉杰;呼吸肌群训练对低氧环境适应特点的研究[D];首都体育学院;2012年

6 廖新根;BMP-2诱导低氧环境下BMSCs向软骨表型分化[D];南昌大学;2012年

7 石海霞;脱离低压低氧环境对大鼠低氧性肺血管重建的影响及氟西汀的干预作用[D];青海大学;2011年

  本文关键词：Fucoidan下调HIF-1α表达抑制淋巴管新生与Hca-F细胞侵袭转移能力的影响及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：322108