Dhh信号通路调控生精小管样结构重构

发布时间：2021-06-24 20:05

　　目的:利用Desert Hedgehog（Dhh）信号通路抑制剂Cyclopamine和激动剂Smoothened agonist（SAG）,探讨Dhh信号通路对生精小管样结构重构的影响及作用机制。方法:将10日龄小鼠睾丸消化细胞进行三维（3 dimensions,3D）立体培养,通过添加Dhh信号通路阻断剂Cyclopamine、激动剂SAG,利用免疫荧光技术检测支持细胞（Sertoli cells,SC）、管周肌样细胞（Peritubular myoid cells,PTM）、睾丸间质细胞（Leydig cells,LC）、生殖细胞（Germ cells,GC）和层粘连蛋白来观察生精小管样结构重构情况;利用活细胞工作站观察生精小管样结构形成过程;利用免疫荧光技术检测睾丸间质细胞、支持细胞、管周肌样细胞、生殖细胞的增殖情况;用Real-time PCR检测Dhh信号通路下游信号分子mRNA表达水平;用Western Blot（WB）检测Dhh信号通路下游信号分子蛋白的表达水平,探讨Dhh信号通路在生精小管样结构重构中的作用及机制。结果:添加抑制剂Cyclopamine后,免疫荧光结果... 

【文章来源】：遵义医科大学贵州省

【文章页数】：60 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

Hedgehog信号通路图

4 种浓度，激动剂 SAG 设置 2.5μM、5μM 2 种浓度来筛选最佳实验浓度。培养 7天后进行免疫荧光染色，结果如图（图 1-1）所示，与阳性对照 KSR+DMF 组相比，随着 Cyclopamine 浓度的增高，支持细胞逐渐失去极性，管周肌样细胞形状为圆形（图 1-1 B-D）。与阴性对照 DMSO 组相比，使用 2.5μM SAG，形态学变化不明显（图 1-1 G）。但是当 SAG 浓度达到 5μM，部分支持细胞表现出极性，管周肌样细胞伸长呈纺锤状，位于支持细胞基底部（图 1-1 H）。并且，1‰浓度的 DMSO 和 DMF 不影响生精小管重构（图 1-1 E, I）。因此，确定后续实验Cyclopamine 的浓度为 20μM，SAG 的浓度为 5μM。

遵义医科大学硕士学位论文闵明25结果如图（图2-1）所示，添加抑制剂Cyclopamine后支持细胞不表现出极性，细胞长轴朝向任意方向；管周肌样细胞基本呈圆形，散在分布（图2-1B）；睾丸间质细胞也零散分布（图2-1E）。而阳性对照组中支持细胞表现出极性，其顶端朝向管腔；管周肌样细胞伸长呈扁形，附着在支持细胞的基底部（图2-1C）；睾丸间质细胞基本在管周肌样细胞的外侧聚集（图2-1F）。在正常的生精小管中，支持细胞会分泌Laminin,沉积于其基底部，参与形成基膜。在Cyclopamine作用下，Laminin的分泌明显受到抑制（图2-1H）。图2-1：抑制剂对生精小管样结构重构的影响.A-C中支持细胞呈现绿色荧光，管周肌样细胞呈现红色荧光。D-F中管周肌样细胞呈现红色荧光，睾丸间质细胞呈现绿色荧光。G-I中支持细胞呈现红色荧光，laminin呈现绿色荧光。(×200)Fig.2-1:Theeffectofinhibitoronthereconstructionoftubule-likestructure.(A–C)SCandPTMweremarkedbySOX-9(green)andα-SMA(red).(D–F)PTMandLCweremarkedbyα-SMA(red)and3β-HSD(green).(G–I)AnalysistheexpressionoflamininandthelocalizationofSCbystainingwithanti-laminin(green)andanti-GATA4(red)antibody.Scalebar=50μm.3.2.2抑制剂对生殖细胞的影响


本文编号：3247744