ANXA3调控小鼠肝癌细胞恶性表型分子机制研究

发布时间：2017-04-29 15:11

  本文关键词：ANXA3调控小鼠肝癌细胞恶性表型分子机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:膜联蛋白A3(Annexin A3,ANXA3)是膜联蛋白家族成员之一,是Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,有36 k Da和33 k Da两种亚型,其异常表达与肿瘤发生发展、耐药性和转移等密切相关。小鼠肝癌Hca-F和Hca-P细胞遗传背景相似但淋巴道转移潜能不同,ANXA3在Hca-F和Hca-P细胞株中均高丰度表达但又有差异,是研究ANXA3与肝癌肿瘤淋巴道转移发生发展的理想模型。目的:1、构建p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Anxa3表达载体,稳定转染Hca-F和Hca-P细胞,筛选ANXA3稳定下调的Hca-F和Hca-P单克隆细胞株;2、构建p EGFP-N1-Anxa3和pc DNA3.1/V5-His B-Anxa3真核表达载体,瞬时转染并在Hca-P细胞中过表达ANXA3;3、考察ANXA3下调对Hca-F细胞体外增殖、迁移和侵袭的影响;4、考察ANXA3下调对Hca-P细胞体外增殖、克隆形成、迁移、侵袭及耐药性的影响;5、研究ANXA3的亚细胞定位;6、考察ANXA3过表达对Hca-P细胞体外增殖、克隆形成、迁移及侵袭的影响;7、系统研究ANXA3调控Hca-F和Hca-P细胞恶性表型的分子调控机制。方法:1、利用在线软件设计Anxa3基因的sh RNA及无关序列(NC,阴性对照),构建p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Anxa3及p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-NC表达载体;2、采用脂质体转染方法,将p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Anxa3/NC表达载体转染至Hca-F和Hca-P细胞,G418抗性筛选及有限稀释法获得ANXA3稳定下调的单克隆细胞株,计算ANXA3下调效率;3、自行设计引物,利用基因工程方法构建p EGFP-N1-Anxa3和pc DNA3.1/V5-His B-Anxa3过表达载体,瞬时转染Hca-P细胞;4、CCK-8法分析ANXA3下调对Hca-F和Hca-P细胞,ANXA3过表达对Hca-P细胞增殖能力的影响;软琼脂克隆实验考察ANXA3下调及过表达对Hca-P细胞克隆形成能力的影响;5、Transwell小室法分析ANXA3的表达对Hca-F和Hca-P细胞迁移侵袭能力的影响;6、CCK-8结合Hoechst33258凋亡染色分析ANXA3下调对Hca-P细胞耐药性及抗顺铂诱导凋亡的影响;7、激光扫描共聚焦实验确定ANXA3蛋白表达的亚细胞定位;8、Western Blot确定ANXA3调控Hca-F和Hca-P细胞恶性行为信号转导通路中相关分子水平变化。结果:1、成功构建p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Anxa3/NC表达载体,获得ANXA3稳定下调的F-ANXA3-sh RNA、P-ANXA3-sh RNA1和P-ANXA3-sh RNA2单克隆细胞株;2、酶切及测序结果表明,p EGFP-N1-Anxa3和pc DNA3.1/V5-His B-Anxa3过表达载体构建成功;3、F-ANXA3-sh RNA细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力分别是阴性对照组的1.62、1.59和2.98倍,ANXA3下调通过激活Erk通路和PI3K/Akt通路增强Hca-F细胞的恶性表型;4、P-ANXA3-sh RNA1(2)细胞的体外增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力分别是阴性对照组的1.13(1.08)、4.06(4.86)、4.98(4.75)和2(2.77)倍,ANXA3下调通过激活Erk和JNK通路增强Hca-P细胞的恶性表型;5、ANXA3过表达后,阴性对照组细胞体外增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力分别提升为上调组的1.19、1.32、2.92和3.4倍,ANXA3的过表达通过抑制Erk和JNK通路来抑制Hca-P细胞的恶性表型;6、激光扫描共聚焦实验结果表明ANXA3蛋白表达主要集中于细胞质中;7、ANXA3下调增强了Hca-P细胞对顺铂的耐药性,对5-FU耐药性无明显影响,ANXA3通过内源性凋亡途径调控Hca-P细胞的cisplatin的耐药性。结论:1、p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Anxa3/NC、p EGFP-N1-Anxa3和pc DNA3.1/V5-His B-Anxa3真核表达载体成功构建;2、获得了ANXA3表达稳定下调的单克隆细胞株;3、ANXA3的下调通过激活Erk通路和PI3K/Akt通路促进Hca-F细胞的体外增殖、迁移和侵袭恶性表型;4、ANXA3的下调增强Hca-P细胞体外增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力,相反,ANXA3的过表达抑制Hca-P细胞体外增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力,主要通过调控Erk和JNK通路来实现;5、ANXA3蛋白表达主要集中于细胞质中;6、ANXA3下调通过内源性凋亡途径来提高Hca-P细胞对顺铂耐药性。
【关键词】：ANXA3 肝癌 Hca-F Hca-P 增殖 迁移 侵袭 耐药性
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 中文摘要8-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 第一部分: ANXA3表达下调增强小鼠肝癌Hca-F细胞恶性表型及分子机制研究16-38
• 一、ANXA3表达稳定下调小鼠肝癌Hca-F细胞株的建立16-23
• 材料和方法16-20
• 结果20-22
• 讨论22-23
• 结论23
• 二、ANXA3对Hca-F细胞恶性表型的影响及分子机制研究23-34
• 材料和方法23-27
• 结果27-31
• 讨论31-33
• 结论33-34
• 参考文献34-38
• 第二部分: ANXA3表达下调增强小鼠肝癌Hca-P细胞恶性表型及分子机制研究38-60
• 一、ANXA3表达稳定下调小鼠肝癌Hca-P细胞株的建立38-44
• 材料和方法38-40
• 结果40-43
• 讨论43
• 结论43-44
• 二、ANXA3对Hca-P细胞恶性表型的影响及分子机制研究44-57
• 材料和方法44-47
• 结果47-54
• 讨论54-56
• 结论56-57
• 参考文献57-60
• 第三部分:ANXA3表达上调降低Hca-P细胞恶性表型及作用机制研究60-78
• 一、构建pEGFP-N1-Anxa3和pc DNA3.1/V5-His B-Anxa3表达质粒60-69
• 材料和方法60-67
• 结果67-68
• 讨论68-69
• 结论69
• 二、ANXA3表达上调对Hca-P细胞恶性表型的影响及分子机制研究69-77
• 材料和方法69-71
• 结果71-76
• 讨论76
• 结论76-77
• 参考文献77-78
• 综述78-94
• 参考文献85-94
• 致谢94-95

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本文编号：335145