AGEs通过调节自噬和氧化应激上调ENPP1参与血管钙化的研究

发布时间：2021-10-07 06:27

　　研究背景和目的血管钙化（Vascular calcification）作为心血管事件的独立危险因素广泛存在于慢性肾脏病及糖尿病患者中,是该疾病人群心血管事件高发的重要因素之一。外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1（Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1,ENPP1）是一种II型跨膜糖蛋白,通过水解生成焦磷酸（PPi）,在软组织异位钙化中起重要作用,但是其在慢性肾脏病及糖尿病患者的血管钙化发生过程中是否起作用仍不清楚。终末期糖基化终产物（Advanced glycation end products,AGEs）作为两者疾病均广泛存在的一种毒素,可能在血管钙化中扮演了重要角色。本研究旨在了解AGEs在诱导血管钙化过程中与ENPP1的相互作用关系,以进一步探讨血管钙化的发生机制。方法（1）通过高糖加牛血清白蛋白的方法孵育AGEs,并用CCK-8试剂盒检测AGEs对体外培养的人主动脉平滑肌细胞系（human aortic smooth muscle cells,HASMCs）的细胞活力的影响。（2）将HASMCs用β-GP单独或者在AGE... 

【文章来源】：重庆医科大学重庆市

【文章页数】：53 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

1孵育90天后的BSA（左）及AGEs（右）

重庆医科大学硕士研究生学位论文19充分震荡混匀，离心之后上机，程序如下：图2.4.4.2PCR程序图Figure2.4.4.2ThePCRprogramdiagram反应结束后，使用BioRadCFXManager软件进行数据分析。2.5Westernblot分析2.5.1细胞总蛋白提取（1）各组细胞在完成处理后，弃去培养基，用预冷的PBS润洗3次；（2）配制细胞裂解液（RIPA:PMSF=100:1）;（3）吸干培养皿中残余液体，将裂解液均匀的滴加在培养皿中，晃动培养皿，使裂解液与细胞充分接触，冰上裂解10min；（4）将细胞及裂解液用细胞刮刮下，转移至EP管中，超声裂解10次；（5）4℃、12000×g低温离心20min；（6）弃去沉淀，将上清液转移至新的EP管中，取少量用于蛋白浓度测定，其余-80℃保存待用。2.5.2蛋白浓度测定（BCA法）（1）取部分蛋白标准品稀释至工作浓度（0.5mg/ml）；

重庆医科大学硕士研究生学位论文23通过CCK-8细胞活性检测试剂盒检测了不同浓度AGEs对HASMCs的细胞活性的影响。分别以0、50、100、200、400和800μg/ml浓度的AGEs和10μM的β-GP处理HASMCs细胞24、48及72h，实验结果发现50-800μg/ml浓度的AGEs对HASMCs细胞活力无明显影响（图3.1）。根据文献，本研究选用200μg/ml浓度的AGEs作为后续实验处理浓度。图3.1AGEs对HASMCs的细胞活力影响Figure3.1EffectsofAGEsoncellviabilityofHASMCs.3.2AGEs协同高磷诱导HASMCs成骨转分化为探究AGEs对HASMCs成骨转分化情况的影响，本研究采用200μg/ml浓度的AGEs在钙化培养情况下（10mMβ-GP）处理HASMCs细胞24小时，RT-qPCR结果显示高磷使HASMCs细胞中RUNX2及BMP2的表达升高，而在AGEs与高磷共同作用组中RUNX2及BMP2进一步表达升高（图3.2a-b）。进一步在相同条件下处理HASMCs细胞7天后，westernblot结果也提示AGEs可以使HASMCs细胞中RUNX2及BMP2的表达明显升高（图3.2c-e）。这些结果提示AGEs可以协同高磷促进HASMCs细胞的成骨转分化。


本文编号：3421528