树突状细胞在Lmdd-MPFG疫苗抗肿瘤作用中的免疫调控机制研究

发布时间：2017-05-03 23:10

  本文关键词：树突状细胞在Lmdd-MPFG疫苗抗肿瘤作用中的免疫调控机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是原发性肝癌中最常见的一种类型,由于其有限的治疗手段,死亡率在恶性肿瘤中居第三位。人们一直努力地探寻着预防和治疗HCC的可行方案,现如今,肿瘤的免疫治疗逐渐成为肝癌研究的热点,例如疫苗的研制以及相关免疫细胞治疗等。减毒李斯特菌因其感染细胞后胞内寄生以及可被清除等特性,已成为肿瘤疫苗载体的理想开发对象。在前期研究中,我们通过一种减毒的李斯特菌Lmdd,利用重组PCR的方法,将肝癌相关融合基因同源重组至该菌中,构建了重组减毒李斯特菌肝癌疫苗Lmdd-MPFG(LM)。并且证实了该疫苗可以诱发特异性抗HCC细胞免疫反应的产生,具有一定的抑瘤效应。同时发现目前已知功能最强的抗原提呈细胞—树突状细胞(Dendritic cell,DC)在LM疫苗发挥抗肿瘤效应的过程中也扮演着重要的角色。然而,DC在LM感染后诱导抗肿瘤免疫效应中是否具有重要的调控地位,以及可能存在的关键性免疫机制,尚不明确。因此,在本研究中,我们着重探讨了DC在LM感染过程中激发抗HCC效应中的免疫调控作用,同时明确了DC的模式识别受体及其介导的相关信号通路在此过程中的具体机制,为进一步阐明肝癌的致病机制及免疫治疗提供新的理论依据。本课题中,我们首先观察了体外LM-MPFG疫苗刺激诱导树突状细胞成熟活化的情况。在体外成功分离诱导出小鼠骨髓来源未成熟DC的基础上,分别用LPS,野生型Lm(WT),Lmdd-MPFG(LM)以及相应菌株的热灭活细菌刺激未成熟DC。收集刺激后各组细胞以及培养上清,分别利用流式细胞术和ELISA检测了刺激后DC表型及细胞因子分泌的变化情况。另外在将刺激前后DC与同体的T细胞共培养后,还通过了3H掺入法以及ELISPOT分别检测了lm介导dc对t细胞增殖及特异性t细胞生成的影响。上述实验结果证实重组lmdd-mpfg体外可有效刺激dc的功能活化,刺激后dc的cd80及cd86表达均明显上调,并且dc在lm刺激后细胞因子的分泌也增多。同时在体外,lm诱导dc活化后也可进一步成功诱导功能性t细胞增殖,促进抗原特异性ctl反应的产生。为明确上述现象的发生机制,本课题还收集了刺激后dc,在mrna以及蛋白水平上筛选和验证了相关tlrs以及nlrs的表达变化情况,并对筛选出的关联性受体下游的相关信号通路进行了探索。结果证实相关模式识别受体如nod1,nlrp3以及tlr4在lm刺激dc成熟过程中发挥着重要的作用,且主要依赖于nf-kb以及caspase-1相关信号通路的调控。进一步以这些dc表达受体作为研究对象,在激动或干扰相应受体后,以流式细胞术检测lm刺激后dc的表型变化,elisa检测细胞因子分泌情况,最后在蛋白水平对这些信号分子的表达进行验证。结果证实nod1/nod2,nlrp3以及tlr4在lm诱导dc活化过程中均表达上调,并且这些相关受体主要通过nf-kb以及caspase-1下游信号通路发挥主要的调控功能。同时lm感染时激动和干扰这些受体均可引起dc相应的表型功能变化,而nod1/nod2,tlr4和nlrp3也被证明在lm诱导dc活化过程中具有的交叉递呈的现象,更好地明确了机制。同时本课题还开展了一系列的体内实验,来进一步探究lm免疫后dc对肿瘤微环境的影响。首先我们建立了皮下肿瘤模型,随后分别尾静脉注射lm,dc联合lm,sinlrp3dc联合lm以及pbs对照,对肿瘤小鼠进行分组免疫。期间分析各组小鼠肿瘤生长大小及生存期发现,lm,尤其在联合dc后,对肿瘤具有很好的免疫抑制效应,而dc中nlrp3的缺失会导致抑瘤功能减弱。另外通过流式细胞术检测免疫肿瘤小鼠脾脏及肿瘤细胞发现,联合dc和lm免疫后,可增强脾脏内的特异性免疫反应发挥抗肿瘤效应,且肿瘤内小鼠特异性t细胞数目增多。同时,dc可以通过增强lm引起的特异性ctl反应,改变t细胞分群,特别是通过il-17a-cd4+t细胞的增多来发挥抑瘤效应。最后我们还验证了在HCC患者肿瘤组织中存在着明显的DC缺陷现象而HCC患者外周血中DC也存在着功能的缺陷,同样在人体内,LM也能通过刺激DC相关NLR及TLR的活化,发挥抑瘤效果。综上所述,本研究证实了DC介导的LM疫苗具有抑制肿瘤效应,其中NOD1,NLRP3以及TLR4等模式识别受体及其下游交叉信号发挥着主要的调控作用。该现象和机制的提出为新型联合疫苗的研制开发提供了可靠的依据。
【关键词】：李斯特菌疫苗 肝细胞肝癌 树突状细胞 模式识别受体
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.51
【目录】：

• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-18
• 参考文献14-18
• 第一部分 李斯特菌减毒疫苗Lmdd-MPFG体外促进BMDCs成熟并诱导特异性免疫应答18-32
• 1.1 材料与方法18-25
• 1.2 结果25-27
• 1.3 讨论27-28
• 参考文献28-32
• 第二部分 相关NLRs及其与TLRs交叉免疫信号通路在LM疫苗活化DC过程中的调控机制研究32-48
• 2.1 材料与方法32-40
• 2.2 结果40-44
• 2.3 讨论44-45
• 参考文献45-48
• 第三部分 肿瘤免疫接种小鼠模型的构建和体内DC促进LM疫苗抑瘤效应的研究48-63
• 3.1 材料与方法48-55
• 3.2 结果55-61
• 3.3 讨论61
• 参考文献61-63
• 第四部分 验证HCC患者DC的功能缺陷及相关受体对LM免疫应答的影响情况63-71
• 4.1 材料与方法63-68
• 4.2 结果68-69
• 4.3 讨论69-70
• 参考文献70-71
• 小结71-72
• 文献综述72-83
• 参考文献77-83
• 缩略语表83-84
• 硕士在读期间发表的论文84-85
• 致谢85

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本文编号：343943