生物制剂TPIN和TPKH的生产工艺、质量标准、稳定性和免疫性研究

发布时间：2021-10-20 20:26

　　目的本课题组前期以减毒沙门氏菌Ty21a为载体构建了两种生物制剂:携带白细胞介素-2（interleukin-2,IL-2）/肝细胞生长因子抑制剂（hepatocyte growth factor antagonist,NK4）双基因的减毒沙门氏菌菌株（简称TPIN）和携带角质细胞生长因子（keratinocyte growth factor,KGF）和低氧诱导因子1α（hypoxia-ind ucible factor-1α,HIF-1α）双基因的减毒沙门氏菌菌株（简称TPKH）,并已完成了TPIN和TPKH的药效学和初步安全性研究。为了使TPIN和TPKH成功应用于临床,本研究将从四个方面进行研究,包括两种制剂的生产工艺优化、质量标准拟定、稳定性评价和免疫性研究。方法（1）生产工艺优化:分别对TPIN,TPKH进行单因素试验,通过平板计数法计算冻干前后存活率,筛选脱脂奶粉、蔗糖、明胶以及二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide,DMSO）保护剂的最佳保护浓度,根据其最佳保护剂浓度设计四因素三水平正交试验优化复合保护剂配比,探索出分别符合TPIN,TPKH的真空冷冻干燥工艺,... 

【文章来源】：甘肃中医药大学甘肃省

【文章页数】：106 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

生长曲线

生物制剂TPIN和TPKH的生产工艺、质量标准、稳定性和免疫性研究24表1-6TPIN正交试验表（x±s，n=3）试验号A脱脂奶粉B蔗糖C明胶DDMSO存活率(%)1111187.049±1.7452122286.437±1.5843133380.174±2.6774212392.641±2.2045223194.326±1.5766231289.987±1.8277313284.514±1.2758321388.030±1.8719332185.809±1.018K184.55388.06888.35589.062K292.31889.59888.29686.979K386.11785.32386.33886.948R7.7654.2742.0172.113`图1-2TPIN因素水平3.2正交试验筛选TPKH复合保护剂配比根据单因素试验分析选择四种保护剂对TPIN和TPKH存活率影响最佳的浓度进行四因素三水平正交试验，结果如表1-8所示。四种保护剂产生的极差大小为RA>RB>RC>RD，即四种保护剂对TPKH真空冷冻干燥后存活率的影响大小排序为脱脂奶粉、蔗糖、明胶、DMSO，其中脱脂奶粉的极差最大，表明脱脂奶粉浓度的变化对TPKH冻干效果影响最大。因此，脱脂奶粉为主要因素，蔗糖次之；对正交试验进行方差分析，结果发现脱脂奶粉、蔗糖、明胶和DMSO均对TPIN冻干存活率产生影响（P<0.01）。由图1-3可知，TPKH冻干保护剂的最佳复合配方应为A2B2C1D1，即脱脂奶粉为15%、蔗糖为10%、明胶为1%、DMSO为0.5%。

生物制剂TPIN和TPKH的生产工艺、质量标准、稳定性和免疫性研究25表1-7TPKH正交试验表（x±s，n=3）试验号A脱脂奶粉B蔗糖C明胶DDMSO存活率（％）1111187.366±2.7232122285.058±0.7143133381.079±3.0474212388.124±1.6355223195.191±1.3836231293.325±1.8177313278.837±1.2698321387.324±1.1029332184.171±3.577K184.50184.77689.33888.910K292.21389.19185.78585.740K383.44486.19285.03685.509R7.7124.4153.5543.400图1-3TPKH因素水平4正交试验验证分析由于正交试验得出的TPIN和TPKH的复合保护剂配方（A2B2C1D1）并未出现在正交试验表中，为了进一步验证此组合的冻干保护效果，以脱脂奶粉为15%、蔗糖为10%、明胶为1%、DMSO为0.5%对TPIN和TPKH进行冻干。结果如表1-8所示。TPIN存活率为（94.553±0.027）%，活菌数可达（4.267±0.156）×109cfu/mL，TPKH存活率为（96.064±0.031）%，活菌数可达（2.430±0.006）×109cfu/mL，其冻干效果优于正交试验表中的任何一组。

【参考文献】：
期刊论文
[1]携带低氧诱导因子-1α及角质细胞生长因子的减毒沙门菌TPHK的构建及其在低氧应激大鼠胃肠组织中的表达[J]. 白燕青,徐倩,曾通旭,曹荟哲,哈小琴.  中国生物制品学杂志. 2017(02)
[2]口服重组减毒沙门菌TPIN抗小鼠黑色素瘤研究[J]. 哈小琴,张尚弟,杨志华,孙琳,郭馨云,彭俊华,董菊子,张媛媛.  解放军医药杂志. 2014(07)
[3]含pCMV-IL-2-IRES-NK4质粒减毒沙门菌的制备及其稳定性研究[J]. 杨志华,哈小琴,张尚弟,冯强生,薛荣利,杨淑娟,赵勇,杨迎桂.  解放军医药杂志. 2014(07)
[4]TPIN对HepG2肝癌细胞生物学特性的影响[J]. 樊红艳,哈小琴,张尚弟,杨志华,宋月娟,李晓云,刘延彤,徐越斌,林静.  解放军医药杂志. 2014(07)

硕士论文
[1]TPHK对应激致大鼠肠黏膜损伤的防护作用初探[D]. 杨志华.甘肃农业大学 2012



本文编号：3447550