胆固醇刺激引起的前列腺癌细胞膜小凹内ATP5B上调对MMP-2的作用研究

发布时间：2021-11-10 04:52

　　正常细胞的细胞膜上胆固醇含量受到严格调控,但多种实体肿瘤（包括前列腺癌）中存在胆固醇代谢异常。胆固醇作为细胞膜脂质的主要组成成分,在细胞膜筏中大量聚集,通过与其他脂质和特定种类的筏蛋白相互作用来稳定膜结构域。胆固醇能够促进ATP5B蛋白异位到细胞膜上,并且观察到前列腺癌细胞PC-3M的迁移侵袭能力增加,而MMP-2能降解细胞外基质的基本骨架Ⅳ型胶原蛋白,破坏肿瘤细胞侵袭转移的组织学屏障,MMP-2的激活也依赖细胞膜。因此我们推测ATP5B异位表达后会影响MMP-2的作用。此外,课题组在乳腺癌细胞MDA-MB-231中通过免疫共沉淀技术得到了ATP5B-Cav-1蛋白复合物,Cav-1仅位于膜筏的小凹中,且将为支架蛋白维持其特有的内凹形态,作为膜筏标志物的Cav-1被认为是前列腺癌发展进程中的重要蛋白。因此,为了进一步明确细胞膜上ATP5B表达对前列腺癌细胞PC-3M侵袭能力的机制影响,我们采用多种促进及抑制模型,探究Cav-1、ATP5B以及MMP-2蛋白之间的关系。方法:1.提取细胞膜蛋白,利用免疫共沉淀方法,检测PC-3M细胞膜表面ATP5B、Cav-1和MMP-2的结合情况。2.... 

【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

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PC-3M细胞质膜MMP-2与ATP5B、Cav-1蛋白结合情况

16醇负荷时间的增加而增加，在12h时表达水平最高，24h稍有下降，与ATP5B蛋白表达变化趋势保持一致。Cav-1蛋白水平在2h时最高，说明胆固醇能最先引起Cav-1蛋白变化，随着时间推移，Cav-1蛋白稍有下降但仍然比基础表达量高，这可能与PC-3M细胞介导胆固醇内流有关。以上结果表明，胆固醇可以有效促进细胞膜表面的ATP5B以及Cav-1表达，同时MMP2的表达量也随之提高。图3.2胆固醇负荷不同时间后细胞膜上ATP5B、MMP-2表达变化情况A：Westernblot检测PC-3M细胞胆固醇负荷0h、2h、6h、12h、24h时细胞膜ATP5B、MMP-2蛋白表达；B-D：0h、2h、6h、12h、24h时细胞膜ATP5B、MMP-2、Cav-1蛋白表达统计结果（**P<0.01、****P<0.0001，n=5）

173.3Cav-1表达下调抑制PC-3M细胞中MMP-2表达及分泌为证明3.2中胆固醇对MMP-2是否有直接影响，我们通过抑制Cav-1在PC-3M中的表达来进行下一步实验。3.3.1稳定转染细胞株的筛选及鉴定3.3.1.1稳定转染细胞株的筛选采用Cav-1基因shRNA的质粒转染细胞，构建PC-3M细胞Cav-1表达下调模型。经5μg/ml嘌呤霉素药物筛选后，扩大培养，形成稳定转染细胞株。荧光显微镜中观察PC-3M细胞Cav-1表达下调模型成功构建（图3.3）。细胞均发绿色荧光，通过随机选取5个400×视野，组合同一视野下明场与荧光图像，计算500个以上细胞，发现转染效率达98％以上。图3.3稳定转染细胞株的筛选（200×）3.3.1.2稳定转染细胞株的鉴定利用Westernblot和PCR实验技术，分别从蛋白和mRNA水平对稳定转染细胞株进行鉴定，即研究转染后Cav-1表达情况。Westernblot（图3.4A和B）和PCR（图3.4C和D）均发现：Cav-1shRNA组与scramble组相比，Cav-1的蛋白表达减少（****P<0.0001,n=3），mRNA水平下调（***P<0.001，n=3），且具统计学意义，说明成功获得稳定抑制Cav-1表达的PC-3M细胞株。


本文编号：3486614