2,5-己二酮诱导大鼠骨髓间充质干细胞凋亡的研究

发布时间：2017-05-07 13:06

  本文关键词：2,5-己二酮诱导大鼠骨髓间充质干细胞凋亡的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:观察2,5-己二酮(HD)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的凋亡作用,探讨相关机制。方法:从大鼠的骨髓中分离提取BMSCs,进行体外培养,观察其形态学特征。流式细胞仪检测其特异标记物CD29、CD90和CD45的表达。经成骨诱导,茜素红染色后观察并拍照;经成脂诱导,油红O染色后观察并拍照。经成神经细胞培养液诱导,免疫组化法检测NSE的表达。以确认其为BMSCs。将第五代BMSCs暴露于0 m M、10 m M、20 m M和40 m M HD中,培养24 h。用噻二苯基四氮唑溴盐(MTT)法观察细胞存活率;进行HE染色,并观察细胞的形态学变化;运用Hoechst 33342染色法和TUNEL-Hoechst双染色法检测细胞凋亡;采用Real Time RT-PCR法检测Bax和Bcl-2基因水平的变化;应用Western-Blotting法检测Bax、Bcl-2蛋白水平的变化;应用JC-1试剂盒检测线粒体跨膜电位的变化;应用Western-Blotting法分别检测线粒体和胞浆中细胞色素C蛋白水平的变化;采用分光光度法检测Caspase-3的活力。用SPSS13.0统计软件对试验结果进行统计分析。结果:1.BMSCs的鉴定BMSCs呈纺锤形,形态大致均匀。流式细胞仪检测其表面标志物CD29、CD90和CD45的表达分别为90.10%、96.61%和0.40%。茜素红染色显示,BMSCs能够分化为成骨细胞;油红O染色显示,BMSCs能够分化为脂肪细胞。诱导24 h、48 h和72 h后NSE的表达分别为29.26%、33.95%和51.86%,而对照组为阴性的标志物,提示BMSCs能够分化为神经细胞。确认所培养的细胞确为BMSCs。2.MTT测定细胞活力HD染毒组BMSCs存活率与对照组相比,显著降低(p0.05),并呈现剂量反应关系。3.凋亡细胞形态HE染色结果显示,染毒BMSCs细胞体变小,突起变短或者消失,且细胞核固缩。Hoechst染色结果表明,染毒BMSCs可见细胞核固缩,甚至出现新月形核等凋亡变化特征。4.细胞凋亡率TUNEL-Hoechst双染色结果显示,10 m M、20m M和40 m M HD染毒组的凋亡指数分别为3.00%、4.12%和18.63%,与对照组相比显著增高(p0.05),并呈现剂量反应关系。5.基因及蛋白表达水平Real Time RT-PCR结果表明,染毒组Bax基因表达水平显著高于对照组(p0.05),并呈现剂量反应关系;而Bcl-2基因表达水平则显著降低(p0.05)。Western Blot检测结果显示,HD染毒组BMSCs的Bax蛋白表达水平显著高于对照组(p0.05),Bcl-2蛋白表达水平则显著下降(p0.05),Bax蛋白与Bcl-2蛋白的表达比率显著高于对照组(p0.05),并呈现剂量依赖性增高。HD染毒组BMSCs胞浆中的细胞色素C蛋白表达水平显著高于对照组(p0.05),线粒体中的细胞色素C蛋白表达水平显著下降(p0.05)。6.MMP变化JC-1染色结果显示,HD染毒组的红绿荧光相对比例均显著低于对照组(p0.05),提示,与对照组相比,HD染毒组BMSCs的线粒体跨膜电位显著下降(p0.05)。7.Caspase-3活力与对照组相比,染毒组BMSCs的Caspase-3活力显著升高(p0.05)。结论:HD诱导BMSCs凋亡;HD激活线粒体依赖的caspase-3信号通路;HD诱导BMSCs凋亡可能与线粒体依赖的caspase-3途径激活有关。
【关键词】：25-己二酮 骨髓间充质干细胞 凋亡 线粒体膜电位 caspase-3活性
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114
【目录】：

• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 材料和方法14-25
• 1. 试剂14-15
• 2. 仪器15
• 3. 实验动物15
• 4. BMSCs的培养15-16
• 5. BMSCs的鉴定16-17
• 6. 实验分组17
• 7. MTT法分析细胞活力17
• 8. HE染色观察细胞形态17
• 9. Hoechst 33342染色观察细胞凋亡形态17-18
• 10. TUNEL-Hoechst双染色检测细胞凋亡指数18
• 11. Real time RT-PCR检测基因表达18-21
• 12. Western-Blotting检测蛋白的表达21-23
• 13. JC-1 检测MMP变化23-24
• 14. 分光光度法检测Caspase-3 活性24
• 15. 统计分析24-25
• 结果25-34
• 1. BMSCs形态及鉴定结果25-26
• 2. HD染毒对细胞活力的影响26-27
• 3. HD染毒对细胞凋亡形态的影响27-28
• 4. HD对BMSCs凋亡率的影响28-30
• 5. HD对中的Bax和Bcl-2 表达的影响30-32
• 6. HD对BMSCs线粒体膜电位的影响32
• 7. HD对BMSCs细胞色素C蛋白表达的影响32-34
• 8. HD对BMSCs中caspase-3 活力的影响34
• 讨论34-38
• 结论38-39
• 参考文献39-44
• 综述44-51
• 参考文献48-51
• 攻读学位期间发表文章情况51-52
• 致谢52-53

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本文编号：349895