肺炎克雷伯菌转录调控子RcsAB和Fur共调控entC基因转录的分子机制研究
发布时间：2021-11-16 17:15
目的:铁摄入系统是肺炎克雷伯菌一种重要的毒力因子,其转录受到菌体的严格调控。铁摄取调节蛋白（Fur）是一种铁响应转录调控子,维持铁稳态;而Rcs调控系统可以调控胞外多糖的合成。目前已知铁摄入系统主要受Fur调控,但关于RcsAB影响铁摄入系统的研究知之甚少。肠菌素作为一种铁载体属于细菌的铁摄入系统。entC编码的异分支酸酶参与肠菌素的合成。通过生物信息学预测,在entC启动子区域可能存在RcsAB和Fur的结合基序。本课题旨在探究肺炎克雷伯菌NTUH-K2044转录调控子RcsAB和Fur对entC基因转录调控的分子机制。方法:CAS实验探究肺炎克雷伯菌NTUH-K2044和Kp:ΔrcsA、Kp:ΔrcsB、Kp:ΔrcsAB及其相应回补株的铁载体含量;用lacZ报告基因融合实验测定在不同铁含量的条件下entC基因启动子的转录活性;在缺铁条件下通过lacZ报告基因融合实验、RT-qPCR、EMSA和DNaseΙ足迹实验分析RcsAB对entC基因转录的调控。利用自杀质粒pKO3-Km通过同源重组无痕敲除fur基因;在铁充足条件下通过RT-qPCR、EMSA和DNaseΙ足迹实验验分析...
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
placZ15-entC重组质粒的构建Figure2ConstructionofrecombinantplasmidplacZ15-entC
重庆医科大学硕士学位毕业论文283.2.4缺铁条件下RcsAB调控entC表达在普通LB培养基中培养CCW01/placZ15-entC,CCW01:ΔrcsA/placZ15-entC,CCW01:ΔrcsB/placZ15-entC和CCW01:ΔrcsAB/placZ15-entC，四株菌的β-半乳糖苷酶活性没有统计学差异（图5）；当在LB培养基中加入100μMFeSO4时，与CCW01/placZ15-entC的β-半乳糖苷酶相比，CCW01:ΔrcsA/placZ15-entC和CCW01:ΔrcsB/placZ15-entC没有统计学差异，CCW01:ΔrcsAB/placZ15-entC的β-半乳糖苷酶增加；当在LB培养基中加入250μMDip时，与CCW01/placZ15-entC的β-半乳糖苷酶相比，其他三株菌的β-半乳糖苷酶明显降低。因此，RcsAB在缺铁条件下正调控entC的表达。图4CCW01/placZ15-entC在含有0,50,100,250μMDip的LB培养基中β-半乳糖苷酶活性。单因素方差分析计算P值，“*”代表P<0.05，其他组均与0μMDip组进行比较。三次独立实验得到平均标准差.Figure4Theβ-galactosidaseofCCW01/placZ15-entCinLBmediumwith0,50,100,250μMDip,respectively.Pvalueswerecalculatedbyone-wayANOVA.*P<0.05，comparedwiththe0μMDipgroup.Shownaretheaverage±standarddeviation(SD)fromindependentexperiments.
重庆医科大学硕士学位毕业论文29图5CCW01/placZ15-entC,CCW01:ΔrcsA/placZ15-entC,CCW01:ΔrcsB/placZ15-entC和CCW01:ΔrcsAB/placZ15-entC在不同条件下β-半乳糖苷酶活性。通过单因素方差分析计算P值，“*”代表P<0.05，其他组均与WT组进行比较。三次独立实验得到平均标准差.Figure5Theβ-galactosidaseofCCW01/placZ15-entC,CCW01:ΔrcsA/placZ15-entC,CCW01:ΔrcsB/placZ15-entCandCCW01:ΔrcsAB/placZ15-entCunderdifferentconditions.Pvalueswerecalculatedbyone-wayANOVA.*P<0.05，comparedwiththeWT.Shownaretheaverage±standarddeviation(SD)fromindependentexperiments.3.3RT-qPCR通过试剂盒，提取并纯化了NTUH-K2044，Kp:ΔrcsA，Kp:ΔrcsB和Kp:ΔrcsAB的细菌总RNA，结果见RNA琼脂糖凝胶电泳图6。当LB培养基中加入250μMDip时，WT中entC基因mRNA的相对表达量明显高于Kp:ΔrcsA，Kp:ΔrcsB和Kp:ΔrcsAB（图7）。因此，当处于缺铁环境时，RcsAB正调控entC的表达，这与lacZ报告基因融合实验的结果一致。
【参考文献】：
期刊论文
[1]铁载体对肺炎克雷伯菌毒力增强的机制研究[J]. 陈杨,刘嘉琳,瞿洪平. 中国感染与化疗杂志. 2016(06)
本文编号：3499248
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【学位级别】：硕士
【部分图文】：
placZ15-entC重组质粒的构建Figure2ConstructionofrecombinantplasmidplacZ15-entC
重庆医科大学硕士学位毕业论文283.2.4缺铁条件下RcsAB调控entC表达在普通LB培养基中培养CCW01/placZ15-entC,CCW01:ΔrcsA/placZ15-entC,CCW01:ΔrcsB/placZ15-entC和CCW01:ΔrcsAB/placZ15-entC，四株菌的β-半乳糖苷酶活性没有统计学差异（图5）；当在LB培养基中加入100μMFeSO4时，与CCW01/placZ15-entC的β-半乳糖苷酶相比，CCW01:ΔrcsA/placZ15-entC和CCW01:ΔrcsB/placZ15-entC没有统计学差异，CCW01:ΔrcsAB/placZ15-entC的β-半乳糖苷酶增加；当在LB培养基中加入250μMDip时，与CCW01/placZ15-entC的β-半乳糖苷酶相比，其他三株菌的β-半乳糖苷酶明显降低。因此，RcsAB在缺铁条件下正调控entC的表达。图4CCW01/placZ15-entC在含有0,50,100,250μMDip的LB培养基中β-半乳糖苷酶活性。单因素方差分析计算P值，“*”代表P<0.05，其他组均与0μMDip组进行比较。三次独立实验得到平均标准差.Figure4Theβ-galactosidaseofCCW01/placZ15-entCinLBmediumwith0,50,100,250μMDip,respectively.Pvalueswerecalculatedbyone-wayANOVA.*P<0.05，comparedwiththe0μMDipgroup.Shownaretheaverage±standarddeviation(SD)fromindependentexperiments.
重庆医科大学硕士学位毕业论文29图5CCW01/placZ15-entC,CCW01:ΔrcsA/placZ15-entC,CCW01:ΔrcsB/placZ15-entC和CCW01:ΔrcsAB/placZ15-entC在不同条件下β-半乳糖苷酶活性。通过单因素方差分析计算P值，“*”代表P<0.05，其他组均与WT组进行比较。三次独立实验得到平均标准差.Figure5Theβ-galactosidaseofCCW01/placZ15-entC,CCW01:ΔrcsA/placZ15-entC,CCW01:ΔrcsB/placZ15-entCandCCW01:ΔrcsAB/placZ15-entCunderdifferentconditions.Pvalueswerecalculatedbyone-wayANOVA.*P<0.05，comparedwiththeWT.Shownaretheaverage±standarddeviation(SD)fromindependentexperiments.3.3RT-qPCR通过试剂盒，提取并纯化了NTUH-K2044，Kp:ΔrcsA，Kp:ΔrcsB和Kp:ΔrcsAB的细菌总RNA，结果见RNA琼脂糖凝胶电泳图6。当LB培养基中加入250μMDip时，WT中entC基因mRNA的相对表达量明显高于Kp:ΔrcsA，Kp:ΔrcsB和Kp:ΔrcsAB（图7）。因此，当处于缺铁环境时，RcsAB正调控entC的表达，这与lacZ报告基因融合实验的结果一致。
【参考文献】：
期刊论文
[1]铁载体对肺炎克雷伯菌毒力增强的机制研究[J]. 陈杨,刘嘉琳,瞿洪平. 中国感染与化疗杂志. 2016(06)
本文编号：3499248
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