CV-A5小鼠主动免疫保护模型建立及候选疫苗体内效力评估

发布时间：2022-02-19 04:56

　　手足口病（hand,foot,mouth diseases,HFMD）已成为我国发病率较高的丙类传染病。人肠道病毒71型（EV-71）、柯萨奇病毒A组、B组、埃可病毒均引起HFMD。2008年HFMD在我国爆发流行,同年被纳入传染病防治法进行管理和检测。随着EV-71疫苗的上市,重症HFMD病例明显减少。但是自2012年以来我国由非EV-71、非柯萨奇病毒A16型（CV-A16）引起的HFMD爆发逐渐增多。在北京、山东、广州、湖南、福州和深圳等省市已超过50%,并且在部分地区达到了80%以上。根据2018年中国疾病控制中心（CDC）发布的HFMD病例数据显示排除EV-71和CV-A16,柯萨奇病毒A6型（CV-A6）和柯萨奇病毒A10型（CV-A10）占比升高,柯萨奇病毒A2型（CV-A2）、柯萨奇病毒A5型（CV-A5）的病例开始增加。而本研究样品的来源湖北襄阳地区,基于EV-71疫苗干预的背景下,2016-2017年期间HFMD患儿的3216份临床样本中分析得知CV-A5的发病率增高至4.57%。为了降低HFMD的发病率,在EV-71疫苗基础上研发多价HFMD疫苗势在必行。但CV-... 

【文章来源】：武汉生物制品研究所湖北省

【文章页数】：123 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
英文缩略词表
中文摘要
Abstract
前言
第一章 实验材料与方法
    1 实验材料
        1.1 病毒,细胞
        1.2 质粒,克隆测序用引物,菌株
        1.3 实验动物
    2 实验试剂
    3 常规实验试剂的配置方法
        3.1 细菌培养相关试剂
        3.2 SDS-PAGE及 WB相关试剂
        3.3 核酸电泳相关试剂
        3.4 IFA实验试剂
        3.5 细胞,病毒培养相关试剂
    4 实验仪器设备
    5 实验方法
        5.1 GST-VP1-ΔN56,GST-VP2-ΔN25,GST-VP3-ΔN8 多克隆抗体的制备
        5.2 细胞培养
        5.3 病毒传代
        5.4 基于RD/Vero细胞基质的相关病毒滴定
        5.5 CV-A5在昆明鼠体内适应性传代
        5.6 基于Vero细胞基质CV-A5 疫苗候选株的筛选,构建,拯救及免疫原性研究
        5.7 CV-A5疫苗候选株生物学特性和免疫原性研究
        5.8 CV-A5主动免疫保护模型的建立
第二章 CV-A5-VP1、VP2、VP3、FP兔多克隆抗体的制备及应用
    1 结果
        1.1 构建pGEX-6p-1-VP1-ΔN56、pGEX-6p-1-VP2-ΔN119、pGEX-6p-1-VP3-ΔN8重组质粒
        1.2 GST-VP1-ΔN56、GST-VP2-ΔN119、GST-VP3-ΔN8 重组融合蛋白可溶性分析
        1.3 Rb-α-VP1、Rb-α-VP2、Rb-α-VP3、Rb-α-FP多克隆抗体效价测定
        1.4 Rb-α-VP1、Rb-α-VP2、Rb-α-VP3、Rb-α-FP多克隆抗体的特异性分析
        1.5 多克隆抗体免疫荧光鉴定
    2 小结
第三章 CV-A5在小鼠体内进行适应性传代
    1 结果
        1.1 CV-A5-M14的筛选过程
        1.2 CV-A5-M14感染14日龄昆明鼠最优的感染途径选择
        1.3 CV-A5-M14 对昆明鼠和Balb/C鼠敏感性比较
        1.4 CV-A5-M14 LD_(50) 测定
        1.5 CV-A5-M14-611,CV-A5-M14-111 两克隆株毒力比较
        1.6 CV-A5-M14-611,CV-A5-M14-111 全基因组序列分析
    2 小结
第四章 CV-A5 疫苗候选株筛选,感染性c DNA的构建及病毒拯救
    1 结果
        1.1 PBR322-CV-A5-rN4,PBR322-CV-A5-rN20 重组质粒构建及线性化
        1.2 体外转录vRNA
        1.3 病毒转染Vero细胞,及连续传代
        1.4 CV-A5-N4-P3,CV-A5-N20-P3 病毒原毒株,拯救株病毒滴度比较
        1.5 CV-V5-vN4-P3,CV-A5-vN20-P3 疫苗候选株生长曲线分析
        1.6 CV-V5-vN4-P3,CV-A5-vN20-P3 全序列比较
    2 小结
第五章 CV-A5 Vero细胞基质抗原纯化及免疫原性研究
    1 实验结果
        1.1 CsCl梯度离心纯化CV-A5 病毒颗粒
        1.2 TEM,SDS-PAGE,WB鉴定病毒颗粒
        1.3 CV-A5 抗原产量比较及EP、FP、DP比例计算
        1.4 中和毒的滴度测定
        1.5 中和毒的鉴定
        1.6 CV-A5免疫原性实验
        1.7 CV-A5-3487 株免疫血清与CV-A5 Swartz株,EV-71 的交叉中和反应
    2 小结
第六章 主动免疫保护实验
    1 结果
        1.1 14日龄昆明鼠主动免疫保护实验存活率、临床评分和体重变化
        1.2 RNA标准品制备
        1.3 病毒载量的测定
        1.4 主动免疫保护模型小鼠中和血清效价测定
        1.5 组织病理切片分析
        1.6 免疫组化切片分析
    2 小结
第七章 总结,讨论与后续实验计划
    1 总结和讨论
    2 研究意义
    3 下一步的工作计划
参考文献
附录
在读期间论文发表情况
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]深圳市龙华区疱疹性咽峡炎病原学特点[J]. 许少坚,郝夏琼,任燕,姚相杰,陈龙,全德甫,赖晓玲,满云翔,刘佳娴,曹赫,林启辉.  中国热带医学. 2019(03)
[2]2014—2016年孝感地区手足口病流行病学及柯萨奇病毒A6和A5型基因特征[J]. 丁穗,李从荣,王远虹,骆胜超,喻珂,张平.  职业与健康. 2018(08)
[3]柯萨奇病毒A组天津分离株的分型鉴定及分子特征分析[J]. 杨东靖,李力,吕莉琨,李佳萌,谭昭麟,苏旭.  国际病毒学杂志. 2016 (04)
[4]Monoclonal neutralizing antibodies against EV71 screened from mice immunized with yeast-produced virus-like particles[J]. Tao Lin,Lingzhi Xianyu,Songya Lyu.  Virologica Sinica. 2015(03)
[5]2008～2009年青岛地区手足口病病原学的调查分析[J]. 汪照国,刘晓琳,杨婷婷,弋英.  病毒学报. 2011(05)
[6]2008年广州地区手足口病的病原学研究[J]. 朱冰,钟家禹,夏慧敏,龚四堂,肖密丝,谢嘉慧,张莹莹,华亮,连广琬.  中华儿科杂志. 2010 (02)
[7]从我国成人手足口病患者疱液中首次分离出肠道病毒71型[J]. 郑志明,张江虹,诸卫平,何佩君.  病毒学杂志. 1989(04)



本文编号：3632260