四株海洋来源微生物胞外多糖的结构和抗氧化活性研究

发布时间：2017-05-14 01:04

  本文关键词：四株海洋来源微生物胞外多糖的结构和抗氧化活性研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：海洋是一种独特复杂的生态系统,蕴含着丰富的生物资源。海洋极端和特殊的生存环境,使海洋微生物演化形成了较为特殊的代谢机制和途径,其产生的胞外多糖在结构和活性功能上新颖多样。本文以4种不同海洋生境来源的微生物发酵液为研究对象,从中分离纯化胞外多糖,并对其进行理化性质分析,结构解析及体外抗氧化活性测定。研究结果如下：1.从黄河三角洲表面盐层泥土耐盐真菌Cladosporium cladosporioides OUCMDZ-2713的发酵液中分离胞外多糖,采用Q Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析及Sephacryl S-100凝胶渗透柱层析对多糖进行进一步分离纯化,得到多糖组分Ms4-1。高效凝胶渗透色谱(HPGPC)和PMP柱前衍生高效液相色谱(HPLC)分析表明,Ms4-1的分子量为19.8 kDa,单糖组成为Man、GlcN、 GlcUA、GalNAc、Glc和Gal,其摩尔比为0.4：0.4：1.0：1.5：2.0：0.2。通过部分酸水解、甲基化分析、核磁共振波谱(1D,2D NMR)和质谱(ESI-MS, ESI-CID-MS/MS)分析表明,Ms4-1主链主要由→3)-β-D-G1cpUA(1→、→4)-β-D-GlcpUA(1→和→3)-α-D-GalpNAc(1→组成的五糖核心结构和Glc长链组成,由Glc组成的长链连接于五糖核心结构中→3)-β-D-GlcpUA(1→的C-3上,Glc长链由→4)-α-D-Glcp(1→组成。体外抗氧化活性测定表明,Ms4-1清除DPPH自由基,超氧阴离子自由基和羟自由基活性的能力高,EC50值分别为1.06 mg/mL、0.21mg/mL和0.58 mg/mL。这是首次从耐盐真菌Cladosporium cladosporioides中获得结构新颖且具有强抗氧化活性的杂多糖,为“海洋糖库”提供了新颖特征的海洋胞外多糖。2.从广西涠洲岛红树林根泥真菌Aspergillus versicolor PJX-9的发酵液中分离胞外多糖,采用Q Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析及Sephacyl S-100凝胶渗透柱层析对多糖进行进一步分离纯化,得到两个多糖组分Pwl-1和Ps1-1。HPGPC分析表明,Pwl-1和Ps1-1的分子量分别为12.3 kDa和13.6 kDa; HPLC分析表明,Pwl-1和Psl-1单糖组成相似,主要由Man组成,还有少量的Glc和Gal,摩尔比分别为9.3：1.3：1.0和6.4：1.1：2.1。甲基化分析表明,Pwl-1主要含有(1→2)-Manp,还有少最(1→6)-Manp.(1→6)-Glcp.(1→2,6)-Manp及未端Manp和Galf。体外抗氧化活性测定表明,Pw1-1清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基的EC50分别为3.39 mg/mL、1.50 mg/mL和1.72 mg/mL。3.从山东东营黄河三角洲自然保护区香蒲共生真菌A-154的发酵液中分离胞外多糖,通过Q Sepharose Fast Flow阴离了交换柱层析及Sephacyl S-100凝胶渗透柱层析纯化得到两个多糖组分Awl-1和Asl-1。HPGPC分析表明,Awl-1和Asl-1分子量分别为11.7 kDa和6.6 kDa: HPLC分析表明,Awl-1含有Man和Gal,其摩尔比为14.1：1.0。甲基化分析表明Awl-1主要含有Manp(1→、 (1→6)-Manp和(1→2,3)-Manp,还有少量Galf(1→及(1→2)-Manp.体外抗氧化活性测定表明,Awl-1具有较强的清除自由基能力,对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除EC50值分别为3.0 mg/mL、1.21 mg/mL和1.50mg/mL。4.从南海文昌霞场红树林共附生真菌A spergillus sp.FJ-6的发酵液中分离胞外多糖,通过Q Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析及Sephacyl S-100凝胶渗透柱层析纯化得到四个多糖组分Fwl-1、Fs1-1、Fs2-1和Fs3-1,分子量分别为11.9 kDa、17.2 kDa、16.4 kDa和18.2 kDa。Fw1-1的单糖组成为Man、Glc和Gal,摩尔比为5.2：1.4：1.0。甲基化分析表明,Fwl-1含有大量(1→2)-Manp、(1→4)-Glcp和(1→2,3)-Manp,少量(1→6)-Manp、Manp(1→、Galf(1→和微量Glcp(1→。大量(1→2,3)-Manp的存在表明Fwl-1是高分支结构,分支点位于(1→2)-Manp的C-3位,Fwl-1结构新颖,在海洋真菌中少见。体外抗氧化活性测定表明,Fwl-1具有较强的清除自由基能力,对DPPH自由基、超氧阴离子和羟基自由基的清除EC50值分别为3.60 mg/mL、1.21 mg/mL和1.64 mg/mL。本论文的研究成果为我国“海洋糖库”提供了结构新颖和抗氧化活性的海洋微生物胞外多糖,为发掘新颖的海洋微生物胞外多糖资源提供了理论依据。
【关键词】：海洋微生物 胞外多糖 结构 抗氧化活性
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R914
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-17
• 前言17-36
• 1 微生物多糖研究概况18-24
• 1.1 微生物多糖的分类18-19
• 1.2 微生物多糖的合成19-23
• 1.2.1 微生物多糖的合成机制19-21
• 1.2.2 微生物多糖的合成基因21-23
• 1.3 生物信息学对多糖结构解析的作用23-24
• 2 海洋微生物胞外多糖的研究24-31
• 2.1 海洋微生物胞外多糖概况24-25
• 2.1.1 海洋微生物胞外多糖的化学组成24-25
• 2.1.2 海洋微生物胞外多糖的合成25
• 2.2 产胞外多糖的海洋微生物资源25-28
• 2.3 海洋微生物发酵策略28-31
• 2.3.1 培养基成分和培养条件的优化28-30
• 2.3.2 发酵培养基成本的降低30-31
• 2.3.3 统计工具的应用31
• 3 多糖的结构研究技术31-35
• 3.1 酸水解32
• 3.2 高效液相色谱(HPLC)分析32-33
• 3.3 红外光谱(IR)分析33
• 3.4 甲基化分析33-34
• 3.5 质谱(MS)分析34
• 3.6 核磁共振(NMR)分析34-35
• 4 本课题的研究背景和意义35-36
• 第一章 黄河三角洲耐盐真菌Cladosporium cladosporioidesOUCMDZ-2713胞外多糖的结构及抗氧化活性研究36-80
• 1 引言36
• 2 材料与仪器36-38
• 2.1 实验原料36-37
• 2.2 实验材料及试剂37
• 2.3 实验仪器37-38
• 3 实验方法38-48
• 3.1 胞外多糖的提取38
• 3.2 胞外多糖的分离纯化38-39
• 3.2.1 离子交换柱层析38-39
• 3.2.2 凝胶渗透柱层析39
• 3.3 纯度分析及分子量测定39
• 3.4 单糖组成分析39-40
• 3.4.1 多糖的完全酸水解40
• 3.4.2 PMP柱前衍生40
• 3.4.3 HPLC色谱分析40
• 3.5 理化性质分析40-43
• 3.5.1 总糖含量的测定40-41
• 3.5.2 蛋白质含量的测定41
• 3.5.3 糖醛酸含量的测定41-42
• 3.5.4 硫酸根含量测定42-43
• 3.6 红外光谱(IR)分析43
• 3.7 部分酸水解43
• 3.8 糖醛酸还原43-44
• 3.9 甲基化分析44-45
• 3.9.1 试剂的处理44
• 3.9.2 甲基化反应44-45
• 3.9.3 完全酸水解45
• 3.9.4 水解产物的还原45
• 3.9.5 还原样品的乙酰化45
• 3.9.6 GC-MS分析45
• 3.10 寡糖的制备45-46
• 3.10.1 寡糖降解条件的摸索45-46
• 3.10.2 寡糖的分离纯化46
• 3.10.3 寡糖的单糖组成分析46
• 3.10.4 寡糖的质谱分析46
• 3.11 核磁共振(NMR)分析46-47
• 3.12 体外抗氧化活性测定47-48
• 3.12.1 DPPH自由基清除活性的测定47
• 3.12.2 超氧阴离子自由基清除活性的测定47-48
• 3.12.3 羟基自由基清除活性的测定48
• 4 结果与讨论48-78
• 4.1 胞外多糖的分离纯化48-50
• 4.1.1 离子交换柱层析48-49
• 4.1.2 凝胶渗透柱层析49-50
• 4.2 纯度分析及分子量测定50-51
• 4.3 单糖组成分析51-52
• 4.4 理化性质分析52-53
• 4.5 红外光谱分析53-54
• 4.6 部分酸水解54-55
• 4.7 糖醛酸还原55
• 4.8 甲基化分析55-61
• 4.8.1 甲基化原理55-57
• 4.8.2 Ms4-1P的甲基化分析57-59
• 4.8.3 Ms4-1PR的甲基化分析59-61
• 4.9 寡糖的制备61-69
• 4.9.1 寡糖降解条件的摸索61
• 4.9.2 寡糖的纯化61-62
• 4.9.3 寡糖的单糖组成测定62-63
• 4.9.4 寡糖的ESI-CID-MS分析63
• 4.9.5 寡糖的ESI-CID-MS/MS分析63-69
• 4.9.5.1 二糖片段F2-2的ESI-CID-MS/MS分析64-66
• 4.9.5.2 三糖片段F2-1的ESI-CID-MS/MS分析66
• 4.9.5.3 四糖片段F1-1的ESI-CID-MS/MS分析66-67
• 4.9.5.4 七糖片段F0-2的ESI-CID-MS/MS分析67-68
• 4.9.5.5 八糖片段F0-1的ESI-CID-MS/MS分析68-69
• 4.10 核磁共振波谱分析69-76
• 4.11 抗氧化活性测定76-78
• 5 本章小结78-80
• 第二章 红树林根泥真菌Aspergillus versiolor PJX-9胞外多糖的结构及抗氧化活性研究80-95
• 1 引言80
• 2 材料与仪器80-81
• 2.1 实验原料80-81
• 2.2 实验材料及试剂81
• 2.3 实验仪器81
• 3 实验方法81-82
• 3.1 胞外多糖的提取81
• 3.2 胞外多糖的分离纯化81
• 3.3 纯度分析及分子量测定81
• 3.4 单糖组成分析81-82
• 3.5 理化性质分析82
• 3.6 红外光谱分析82
• 3.7 甲基化分析82
• 3.8 抗氧化活性测定82
• 4 结果与讨论82-94
• 4.1 胞外多糖的分离纯化82-84
• 4.1.1 离子交换柱层析82-83
• 4.1.2 凝胶渗透柱层析83-84
• 4.2 纯度分析及分子量测定84-85
• 4.3 单糖组成分析85-86
• 4.4 理化性质分析86-87
• 4.5 红外光谱分析87
• 4.6 甲基化分析87-92
• 4.7 抗氧化活性测定92-94
• 5 本章小结94-95
• 第三章 黄河三角洲香蒲共生真菌A-154胞外多糖的结构及抗氧化活性研究95-107
• 1 引言95
• 2 材料与仪器95-96
• 2.1 实验原料95-96
• 2.2 实验材料及试剂96
• 2.3 实验仪器96
• 3 实验方法96-97
• 3.1 胞外多糖的提取96
• 3.2 胞外多糖的分离纯化96
• 3.3 纯度分析及分子量测定96
• 3.4 单糖组成分析96
• 3.5 理化性质分析96-97
• 3.6 红外光谱分析97
• 3.7 甲基化分析97
• 3.8 抗氧化活性测定97
• 4 结果与讨论97-106
• 4.1 胞外多糖的分离纯化97-99
• 4.1.1 离子交换柱层析97-98
• 4.1.2 凝胶渗透柱层析98-99
• 4.2 纯度分析及分子量测定99-100
• 4.3 单糖组成分析100-101
• 4.4 理化性质分析101
• 4.5 红外光谱分析101-102
• 4.6 甲基化分析102-104
• 4.7 抗氧化活性测定104-106
• 5 本章小结106-107
• 第四章 红树林共附生真菌Aspergillus sp.FJ-6胞外多糖的结构及抗氧化活性研究107-122
• 1 引言107
• 2 材料与仪器107-108
• 2.1 实验原料107-108
• 2.2 实验材料及试剂108
• 2.3 实验仪器108
• 3 实验方法108-109
• 3.1 胞外多糖的提取108
• 3.2 胞外多糖的分离纯化108
• 3.3 纯度分析及分子量测定108
• 3.4 单糖组成分析108
• 3.5 理化性质分析108-109
• 3.6 红外光谱分析109
• 3.7 甲基化分析109
• 3.8 抗氧化活性测定109
• 4 结果与讨论109-120
• 4.1 胞外多糖的分离纯化109-112
• 4.1.1 离子交换柱层析109-110
• 4.1.2 凝胶渗透柱层析110-112
• 4.2 纯度分析及分子量测定112-113
• 4.3 单糖组成分析113-115
• 4.4 理化性质分析115
• 4.5 红外光谱分析115-116
• 4.6 甲基化分析116-119
• 4.7 抗氧化活性测定119-120
• 5 本章小结120-122
• 参考文献122-134
• 结语134-137
• 致谢137-138
• 发表的学术论文138-139
• 个人简历139

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