POLE2基因沉默通过调控PLK1表达抑制肺腺癌细胞的增殖

发布时间：2022-02-24 18:58

　　目的:在肺腺癌细胞中筛选POLE2（DNA聚合酶εB亚基）基因的下游关键基因,进一步研究PLK1基因的增殖及凋亡功能,验证PLK1基因与POLE2基因的功能相关性,初步探索POLE2基因的作用机制,为阐明POLE2基因抗肿瘤作用的分子机制奠定基础。方法:（1）设计合成针对POLE2 siRNA靶序列的寡核苷酸单链,包装完成慢病毒表达载体并感染肺腺癌A549细胞。（2）对照组（shCtrl组）及实验组（shPOLE2组）慢病毒转染的肺腺癌细胞72小时后于倒置荧光显微镜下拍照,初步筛选转染效率达到80%的细胞株,细胞状态正常即可进行下一步实验。（3）提取shCtrl组及shPOLE2组肺腺癌细胞总RNA,采用qPCR检测POLE2基因在mRNA水平的沉默效率。同时进一步应用免疫印迹法（Western blot）检测干扰靶点的有效性。（4）采用Trizol试剂盒对6个样品总RNA的进行抽提,样品质控合格后进入芯片实验:（1）差异基因的筛选标准:符合FDR（False Discovery Rate）<0.05和︳FC︳（︳Fold Change︳）>2,且P值<0.05。（2... 

【文章来源】：延安大学陕西省

【文章页数】：51 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
缩略词中英文对照表
第一章 引言
第二章 材料与方法
    2.1 细胞来源和细胞培养
    2.2 shPOLE2 慢病毒载体构建、慢病毒的产生及细胞感染
    2.3 实时荧光定量核酸扩增检测系统验证shPOLE2 的沉默效率
    2.4 Western blot检测POLE2 基因的沉默效率
    2.5 人类全基因组表达谱芯片分析技术筛选POLE2基因改变引起的差异基因
    2.6 生物信息学分析
    2.7 qPCR技术验证30个下游关键基因
    2.8 Western blot 检测POLE2基因沉默后PLK1基因蛋白水平的表达变化
    2.9 shPLK1慢病毒载体的构建、慢病毒的产生及细胞感染
    2.10 Western blot检测PLK1 基因的沉默效率
    2.11 CCK-8 法检测沉默PLK1 对于细胞增殖能力的影响
    2.12 流式细胞术检测沉默PLK1对细胞周期的影响
    2.13 流式细胞术检测沉默PLK1对细胞凋亡的影响
    2.14 统计学分析
第三章 结果
    3.1 检测POLE2基因的沉默效率
    3.2 人类全基因组表达谱芯片分析技术筛选差异表达基因
        3.2.1 芯片数据的质量评估
        3.2.2 基因芯片筛选下游差异基因
        3.2.3 显著性差异基因的生物信息学分析
    3.3 利用qPCR鉴定下游30个基因在mRNA水平的表达
    3.4 沉默POLE2 后检测下游基因PLK1在mRNA及蛋白水平表达
    3.5 检测PLK1基因的沉默效率
    3.6 PLK1基因沉默抑制A549和NCI-H1299细胞增殖
    3.7 PLK1基因沉默对A549和NCI-H1299细胞周期的影响
    3.8 PLK1 基因沉默对A549和NCI-H1299 细胞凋亡的影响
第四章 讨论
    4.1 POLE2基因在肺腺癌发生发展中的重要作用
    4.2 POLE2基因与下游基因的关系
    4.3 下游关键基因PLK1基因对肺腺癌细胞功能的影响
第五章 结论
第六章 展望与不足
参考文献
附录1
致谢
攻读硕士学位期间的研究成果


【参考文献】：
期刊论文
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[3]FoxM1调节网络——抗癌新靶点[J]. 时佳琪,刘超,张艳桥.  现代肿瘤医学. 2019(06)
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[7]β-榄香烯对肺癌A549细胞的差异基因筛选及鉴定[J]. 李娜苗,张莹莹,范亚莉,赵钰玲,董娅,李建英.  现代肿瘤医学. 2018(11)
[8]榄香烯抗肺癌作用的研究进展[J]. 于海如,于韬.  辽宁医学杂志. 2018(02)
[9]中国肺癌和烟草流行及控烟现状[J]. 邹小农,贾漫漫,王鑫,支修益.  中国肺癌杂志. 2017(08)
[10]POLE突变在肿瘤发生发展中的作用[J]. 黄茜,张声.  临床与病理杂志. 2015(12)

博士论文
[1]SIX1促进宫颈癌细胞增殖和转移[D]. 刘眈.华中科技大学 2014



本文编号：3643324