女贞苷和TBC1D1调控脂联素高聚化的机制研究

发布时间：2017-05-16 04:03

  本文关键词：女贞苷和TBC1D1调控脂联素高聚化的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：脂联素(Adiponectin)是脂肪细胞分泌水平最高的脂肪因子,血浆中主要以低聚体、中聚体和高聚体三种聚体形式存在。三种聚体功能各不相同,其中高聚体是脂联素调节代谢功能的主要形式,具有提高胰岛素敏感性的功能。脂联素高聚体与总量比值(HMW/Total Ad)常常被用来衡量脂联素高聚化水平,可以作为预测和诊断胰岛素抵抗相关疾病的生物指标。AMPK是一种苏氨酸/丝氨酸激酶,在细胞中调节能量代谢。我们前期研究证明,激活AMPK可以促进脂联素的高聚化。女贞苷是中药材女贞子的主要药理活性成分,临床主要用于治疗须发早白、眩晕耳鸣、目暗不明等症。本研究发现,女贞苷在HEK293T和3T3-L1脂肪细胞中均能有效激活AMPK;在3T3-L1细胞中通过激活AMPK促进脂联素高聚体的组装。为了进一步研究AMPK调控脂联素高聚化的分子机制,实验前期通过免疫共沉淀、质谱检测等技术发现了脂联素结合蛋白TBC1D1。该蛋白是一种GTPase激活蛋白,含有多个磷酸化位点,主要有Ser237,Thr596等,能被AMPK磷酸化。本研究通过在3T3-L1细胞中沉默TBC1D1蛋白,HEK293T细胞中过量表达脂联素和TBC1D1(及其突变体)发现,TBC1D1去磷酸化状态可以提高细胞中HMW/Total Ad的比值,促进脂联素高聚体的组装。通过间接免疫荧光染色技术发现,去磷酸化状态的TBC1D1有利于它在细胞中和脂联素的共定位。本课题一方面发现了一种新的有效的AMPK激活剂女贞苷,另一方面初步阐明了TBC1D1作为AMPK下游蛋白对脂联素高聚体的组装所发挥的作用:TBC1D1通过被AMPK磷酸化和去磷酸化,调控脂联素的总量和高聚体的组装。
【关键词】：脂联素 AMPK TBC1D1 女贞苷 高聚化
【学位授予单位】：清华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 主要符号对照表8-9
• 第1章 前言9-21
• 1.1 脂联素9-13
• 1.1.1 脂联素的结构9
• 1.1.2 脂联素的表达及调控9-10
• 1.1.3 脂联素的组装和分泌10-12
• 1.1.4 脂联素的功能和作用机制12-13
• 1.2 AMPK13-16
• 1.2.1 AMPK的结构13-14
• 1.2.2 AMPK的功能14-15
• 1.2.3 AMPK的激活机制与AMPK激活剂15-16
• 1.3 TBC1D116-18
• 1.3.1 TBC1D1基因和蛋白结构16
• 1.3.2 TBC1D1的功能和作用机制16-17
• 1.3.3 TBC1D1的磷酸化17-18
• 1.4 女贞苷18-19
• 1.5 研究目的和意义19-21
• 第2章 实验材料与实验方法21-32
• 2.1 实验材料21-24
• 2.1.1 实验用细胞21
• 2.1.2 实验试剂与药品21-23
• 2.1.3 主要实验仪器23-24
• 2.2 实验方法24-32
• 2.2.1 基因定点突变24-25
• 2.2.2 3T3-L1前体脂肪细胞培养与诱导分化25-26
• 2.2.3 HEK293T细胞培养与转染26-27
• 2.2.4 RNA干扰（RNAi）27
• 2.2.5 蛋白质印迹（Western Blotting）27-29
• 2.2.6 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,Co-IP）29-30
• 2.2.7 免疫荧光染色30
• 2.2.8 高效液相色谱（HPLC）30-31
• 2.2.9 实验数据采集处理及统计学分析31-32
• 第3章 女贞苷通过激活AMPK促进脂联素的高聚化32-39
• 3.1 本章导论32
• 3.2 女贞苷在HEK293T细胞中激活AMPK32-33
• 3.3 女贞苷通过提高细胞中AMP/ATP的比值激活AMPK33-34
• 3.4 女贞苷在 3T3-L1脂肪细胞中激活AMPK34-35
• 3.5 女贞苷在 3T3-L1成熟脂肪细胞中促进脂联素组装35-36
• 3.6 女贞苷通过激活AMPK促进脂联素高聚化36-38
• 3.7 本章小结38-39
• 第4章 TBC1D1调控脂联素的高聚化39-52
• 4.1 本章导论39
• 4.2 TBC1D1在脂肪细胞中的表达39-40
• 4.3 TBC1D1与脂联素的结合40-41
• 4.3.1 HEK293T细胞中TBC1D1与脂联素的结合40-41
• 4.3.2 3T3-L1成熟脂肪细胞中TBC1D1与脂联素的结合41
• 4.4 TBC1D1对脂联素高聚体组装的影响41-46
• 4.4.1 HEK293T中过量表达TBC1D1降低脂联素高聚化水平41-43
• 4.4.2 3T3-L1成熟脂肪细胞中沉默TBC1D1降低脂联素高聚化水平43-44
• 4.4.3 TBC1D1调控脂联素高聚化受上游信号通路介导44-46
• 4.5 磷酸化的TBC1D1抑制脂联素高聚化46-47
• 4.6 过表达TBC1D1磷酸化位点突变体降低脂联素的总量47-49
• 4.7 脂联素和TBC1D1在HEK293T细胞中的亚定位49-50
• 4.8 本章小结50-52
• 第5章 讨论与展望52-55
• 5.1 讨论52-54
• 5.1.1 实验结果52-53
• 5.1.2 TBC1D1在不同细胞中的作用53
• 5.1.3 TBC1D1和脂联素的关系53-54
• 5.1.4 TBC1D1磷酸化的检测54
• 5.2 展望54-55
• 5.2.1 优化AMPK激活剂筛选方法54
• 5.2.2 研究TBC1D1和脂联素的相互作用54
• 5.2.3 研究TBC1D1蛋白在脂肪细胞中的其他功能54-55
• 参考文献55-62
• 致谢62-64
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果64

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