具有人参皂苷转化能力的微生物的筛选及其对Rb1的转化研究

发布时间：2023-03-20 04:48

　　西洋参(panax quinquefolius),隶属于五加科人参属,其功效以及外观与我国传统人参类似,根部含有丰富的活性成分,是一种具有极高经济价值的药材,在传统中药材方面具有悠久的应用历史,具有滋阴补气,延缓衰老,抗疲劳,消炎,抗肿瘤等多种药用功效。2019年西洋参被列为既是食品又是中药材的物质生产经营试点。药理学研究表明,人参皂苷为其中的主要生理活性成分,如何提高人参皂苷的含量及转化稀有人参皂苷成为多年来的研究热点问题。西洋参中含有三种类型的皂苷:分别为达玛烷型和齐敦果烷型和奥克悌隆型。主要的人参皂苷属于四环三萜类达玛烷型,通过对比C-3、C-6和C-20位置上糖苷配体的不同,达玛烷型皂苷又可以分为原人参二醇型(PPD)和原人参三醇型(PPT)两种。人参皂苷的微生物转化主要是利用微生物产生的酶对PPD皂苷的C-3、C-20位以及PPT皂苷的C-6和C-20位的糖苷配基进行修饰,使得含量较高的人参皂苷的糖基水解从而转化为稀有人参皂苷,并且生物转化法具有无污染、生产成本小等特点。本论文从西洋参根际土壤中分离出一株可以特异性转化人参皂苷Rb1为稀有人参皂苷CK的菌株,提取了该菌株的DN...

【文章页数】：79 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 绪论
    1.1 西洋参的简介
    1.2 人参皂苷的简介
        1.2.1 人参皂苷的化学结构
            1.2.1.1 齐敦果烷型皂苷的分子结构
            1.2.1.2 原人参二醇型皂苷的分子结构
            1.2.1.3 原人参三醇型皂苷的分子结构
            1.2.1.4 奥克悌隆醇型皂苷的分子结构
    1.3 人参皂苷的提取分离
        1.3.1 人参皂苷的传统提取方法
            1.3.1.1 回流提取法
            1.3.1.2 索氏提取法
        1.3.2 人参皂苷的现代提取方法
            1.3.2.1 微波辅助提取法
            1.3.2.2 超高压提取法
            1.3.2.3 超临界CO2流体萃取提取法
            1.3.2.4 仿生提取法
    1.4 人参皂苷的转化
        1.4.1 化学转化法
        1.4.2 生物转化法
    1.5 人参皂苷的检测方法
        1.5.1 高效液相色谱法
        1.5.2 薄层色谱法
        1.5.3 核磁共振法
    1.6 人参皂苷转化酶的分离纯化
        1.6.1 糖苷酶的分类
        1.6.2 糖苷酶在人参皂苷合成中的应用
        1.6.3 β-葡萄糖苷酶的分类
        1.6.4 β-葡萄糖苷酶的催化机制
        1.6.5 β-葡萄糖苷酶活性的测定方法
        1.6.6 β-葡萄糖苷酶的分离
        1.6.7 β-葡萄糖苷酶的纯化
    1.7 论文研究的目的、意义和内容
        1.7.1 论文研究的目的、意义
        1.7.2 论文研究的技术路线
        1.7.3 论文研究的主要内容
            1、筛选出能转化人参皂苷 Rb1、Re 的菌株
            2、对筛选到的能转化人参皂苷 Rb1、Re 的菌株进行分子生物学的分类鉴定
            3、对菌株转化人参主皂苷为稀有人参皂苷的转化条件进行优化
            4、转化路径的确定
2 人参皂苷转化菌株的筛选
    2.1 实验材料和仪器
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 实验试剂
        2.1.3 实验仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 菌株的筛选
            2.2.1.1 稀释液的制备
        2.2.2 菌株的初筛
        2.2.3 菌株的分离纯化
        2.2.4 产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选
        2.2.5 能转化人参皂苷Rb1和Re菌株的筛选
        2.2.6 TLC检测
            2.2.6.1 人参皂苷Rb1、Re转化结果的检测
            2.2.6.2 人参皂苷Rb1、Re转化产物的检测
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 菌株的初筛结果
        2.3.2 产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选结果
        2.3.3 TLC检测结果
            2.3.3.1 能转化Rb1的菌株的TLC分析
            2.3.3.2 能转化Re的菌株的TLC分析
            2.3.3.3 Rb1转化产物的TLC鉴定
            2.3.3.4 Re转化产物的TLC鉴定
    2.4 小结与讨论
3 人参皂苷Rb1、Re转化菌株的分类鉴定
    3.1 实验材料与仪器
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 实验试剂
        3.1.3 实验仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 菌株DNA的提取
        3.2.2 菌株基因组DNA的 PCR扩增
            3.2.2.1 菌株S’10和菌株S’12的PCR扩增体系
            3.2.2.2 菌株A1、A3、C2和C3的PCR扩增体系
            3.2.2.3 菌株S’10和菌株S’12的PCR扩增条件
            3.2.2.4 菌株A1、A3、C2和C3的PCR扩增条件
        3.2.3 PCR扩增产物的分析
        3.2.4 菌株16srDNA的测序及序列比对
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 菌株的测序结果
    3.4 菌株系统进化树的构建
    3.5 小结与讨论
4 菌株转化条件的优化及转化路径的分析
    4.1 实验材料与仪器
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 实验试剂
        4.1.3 实验仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 菌种的培养
        4.2.2 生长曲线的测定
        4.2.3 粗酶液的制备
        4.2.4 pNP浓度与吸光度值标准曲线的绘制
        4.2.5 酶活检测
        4.2.6 CK标准曲线的建立
        4.2.7 人参皂苷Rb1转化产物的分析及转化得率的分析
    4.3 人参皂苷Rb1转化条件的优化
        4.3.1 温度对人参皂苷Rb1转化的影响
        4.3.2 pH对人参皂苷Rb1转化的影响
        4.3.3 不同转化时间对人参皂苷Rb1转化的影响
    4.4 转化路径的分析
    4.5 结果与讨论
        4.5.1 菌株生长曲线的测定结果
        4.5.2 pNP浓度与吸光度值标准曲线的绘制
        4.5.3 酶活的检测结果
        4.5.4 建立的CK标准曲线图
        4.5.5 Rb1转化产物及转化得率的分析
        4.5.6 最佳转化温度的确定
        4.5.7 最佳转化pH的确定
        4.5.8 最佳转化时间的确定
        4.5.9 转化路径的确定
    4.6 小结与讨论
5 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 展望
参考文献
致谢
附录一 攻读学位期间发表的学术论文



本文编号：3766720