人55型腺病毒单克隆中和抗体的制备及表位分析

发布时间：2023-10-21 14:55

　　人55型腺病毒(HAdV55)是近年来发现的由HAdV11与HAdV14重组而来的新型B种腺病毒。由于HAdV55在人群中的预存免疫普遍较低,容易在人群密集的地方如医院、军队、学校等地爆发,可致重症呼吸道疾病甚至死亡,给社会带来严重危害。为减少HAdV55爆发带来的危害,我们亟需一种能够有效阻止其在人群中传播的药物。抗体是指在抗原刺激下由浆细胞产生的一种呈Y字型、对机体具有保护作用的蛋白质,单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的抗体,具有高度均一、仅能针对某一特定抗原表位的特点。抗体与相应抗原结合之后可以阻断抗原对机体的感染,在临床上广泛用于疾病的诊断、治疗及预防,而目前针对可引起严重暴发感染的HAdV55抗体制备的相关研究报道很少,因此本课题拟在本实验室已有HAdV55候选疫苗及HAdV14-55高变区嵌合病毒的基础上,利用单细胞PCR技术,从免疫猕猴中克隆出HAdV55特异性的单克隆抗体,并进行活性分析和表位分析。本论文的主要研究工作概括如下:研究目的获得具有良好结合、中和作用的HAdV55单克隆抗体,以期用于HAdV55的治疗;鉴定抗体与HAdV55的结合表位与中和表位,以期为HAd...

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摘要
abstract
第1章 引言
    1.1 腺病毒概述
        1.1.1 腺病毒简介
        1.1.2 腺病毒感染机制
        1.1.3 腺病毒载体
        1.1.4 HAdV55及其亲本腺病毒
    1.2 单克隆抗体
        1.2.1 单克隆抗体制备方法
        1.2.2 抗体药物在治疗病毒感染上的应用
        1.2.3 腺病毒单克隆抗体作用机制
第2章 单个B细胞克隆法筛选HAdV55中和抗体
    2.1 实验材料
        2.1.1 分子克隆常用试剂
        2.1.2 蛋白质电泳相关试剂
        2.1.3 细胞培养和质粒转染相关试剂
        2.1.4 ELISA相关试剂
        2.1.5 中和实验相关试剂
    2.2 实验分析及作图软件
    2.3 实验相关仪
    2.4 实验方法
        2.4.1 HAdV55候选疫苗免疫中国猕猴
        2.4.2 分离免疫猕猴外周血单个核细胞
        2.4.3 流式分选 HAd V55 特异性记忆细胞
        2.4.4 逆转录及单细胞 PCR 扩增抗体基因片段
        2.4.5 抗体基因克隆
        2.4.6 线性化载体制备
        2.4.7 抗体基因与对应载体连接
        2.4.8 连接产物转化
        2.4.9 菌液 PCR 鉴定阳性克隆
        2.4.10 测序结果分析
        2.4.11 抗体基因在293T细胞中的表达
        2.4.12 考马斯亮蓝染色检测抗体表达
        2.4.13 ELISA 检测抗体与 HAd V55 的结合能力
        2.4.14 基于碱性磷酸酶的微量中和实验测定 HAd V55 单克隆抗体中和能力
        2.4.15 293F细胞生产单克隆抗体
        2.4.16 Protein A凝胶柱纯化抗体
        2.4.17 Western Blot鉴定结合表位
        2.4.18 病毒微量中和实验鉴定中和表位
第3章 研究结果
    3.1 HAdV55特异性单克隆抗体基因获取
        3.1.1 HAdV55候选疫苗免疫中国猕猴
        3.1.2 流式细胞仪分选HAdV55特异性记忆B细胞
        3.1.3 单细胞PCR获取抗体基因
        3.1.4 克隆表达载体
        3.1.5 菌液PCR及测序验证
        3.1.6 抗体表达
        3.1.7 抗体活性检测
        3.1.8 抗体大量表达及EC₅₀、IC₅₀测定
        3.1.9 结合表位、中和表位鉴定
第4章 结论与讨论
    4.1 结论
    4.2 讨论
参考文献
致谢
附录 A 各试剂盒使用操作说明书
附录 B 质粒载体 Heavy 链、Kappa 链、Lammbda 链示意图
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果



本文编号：3856059