CrkL调控人慢性粒细胞白血病K562细胞的恶性行为及分子机制研究

发布时间：2017-05-27 04:07

  本文关键词：CrkL调控人慢性粒细胞白血病K562细胞的恶性行为及分子机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML),是起源于骨髓的一种多能造血干细胞恶性克隆增殖性疾病。在我国CML在白血病中占的比例约为20%,仅次于急粒和急淋位居第三位。绝大多数CML具有特征性的Ph染色体。Ph染色体是9号染色体和22号染色体之间发生易位作用,即t(9;22)(q34;q11),这样的易位作用使位于第9号染色体q34的ABL基因与第22号染色体q11的BCR基因形成了BCR-ABL融合基因(5'-3'),该基因编码的BCR-ABL融合蛋白分子量为210Kda,具有异常的酪氨酸激酶活性。目前的研究表明,BCR-ABL蛋白激酶可以诱发多条信号转导通路的异常激活(简称BCR-ABL通路),引起细胞过度增殖,凋亡受抑制以及粘附、迁移侵袭能力的改变,最终导致细胞的恶性转化。Crk最初作为一种癌基因产物发现于禽类肉瘤病毒CT10(chicken tumor 10)中,主要由SH2(src homology 2)和SH3(src homology 3)结构域组成。Crk家族包括三个成员:Crk I、Crk II和Crk L,在各个组织中广泛表达。近年来的研究表明:Crk L异常表达与肿瘤生物学行为密切相关,但Crk L与慢性粒细胞白血病(CML)发病机制及可能参与的信号通路的研究相对较少。在BCR-ABL通路中Crk L作为BCR-ABL通路中BCR-ABL激酶的重要的底物之一,在细胞中以持续性磷酸化的状态存在,通过其SH2、SH3结构域可以招募各通路信号转导分子,起着信号开关的作用,在BCR-ABL通路中扮演重要的角色。目的:1、构建p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Crk L表达载体并稳定转染至CML细胞株K562中,获得Crk L表达稳定下调的单克隆sh RNA-Crk L-K562细胞株;2、研究Crk L下调对K562细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭、周期、凋亡、耐药性生物学行为影响;3、研究Crk L在慢性粒细胞白血病中主要参与的分子机制。方法:1、依据Crk L的m RNA序列(NM_005207.3),利用si Direct和whitehead软件设计针对Crk L的si RNA,同时设计无关序列作为阴性对照。利用Lipofectamine 2000介导法,将构建好的p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Crk L表达载体及p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-control无关序列表达载体分别转染至K562细胞中,24h后荧光显微镜下观察转染效率,经500ug/ml G418筛选及有限稀释法获得稳定转染的K562单克隆细胞株。采用q RT-PCR和Western Blot验证各组单克隆细胞、单克隆无关序列细胞和K562细胞株中Crk L蛋白的表达水平。2、透射电镜观察下调对K562细胞亚显微结构的影响;3、台盼蓝计数法测定Crk L下调对K562细胞增殖能力的影响;4、甲基纤维素半固体培养基培养各组细胞株测定Crk L下调对K562细胞克隆形成能力的影响;5、Transwell小室测定Crk L下调对K562细胞迁移和侵袭能力的影响;6、流式细胞术检测Crk L下调对K562细胞周期的影响;7、Heochst33342染色检测Crk L下调对K562细胞凋亡和Imatinib mesylate耐药性影响;8、q RT-PCR和Western Blot研究Crk L下调对K562细胞生物学行为影响的分子机制。结果:1、设计了3条针对Crk L的si RNA,且成功构建了3种重组质粒:p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Crk L-439、p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Crk L-710、p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Crk L-796;2、筛选得到20株单克隆细胞株,q RT-PCR和Western blot结果表明:相对于阴性对照组,在sh RNA-Crk L-K562(1),sh RNA-Crk L-K562(2)下调细胞株中Crk L的表达水平明显减少,其m RNA下调率分别是84.2±1.2%和79.1±0.1%;蛋白水平下调率91.0±1.8%和87.5±0.3%,sh RNA-Crk L-K562(1),sh RNA-Crk L-K562(2)下调细胞株作为后续的功能实验细胞株;3、在透射电镜下观察,下调细胞株中线粒体出现明显肿大现象,表明细胞有前期凋亡迹象;4、台盼蓝细胞计数检测结果显示:下调细胞株在细胞培养48小时后,增殖速度显著低于阴性对照组(P0.05);5、Transwell小室细胞迁移和侵袭检测结果显示:在sh RNA-Crk L-K562(1),sh RNA-Crk L-K562(2)下调细胞株中,迁移和侵袭的细胞数明显少于阴性对照组(P0.05);6、甲基纤维素克隆形成实验结果显示:下调细胞株克隆形成的数目和克隆形成的体积都明显低于阴性对照组(P0.05);7、sh RNA-Crk L-K562(1),sh RNA-Crk L-K562(2)下调细胞株与阴性对照组相比,Crk L下调使细胞周期阻滞于S期;8、Heochst33258染色检测结果显示:Crk L下调细胞出现轻微的凋亡,同时对Imatinib mesylate的敏感性更强;9、Crk L下调能够促进K562细胞向巨核细胞分化;10、分子机制研究表明,Crk L在K562细胞中通过PI3K-Akt/m TO R通路、MAPK通路、FAK/Src通路、Crk L-STAT5通路和p130CAS/Crk L/Dock180/RAC1通路来影响K562细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭、Imatinib mesylate耐药性。结论:1、成功构建了p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Crk L和对照组表达载体;2、成功获得Crk L表达稳定下调的单克隆细胞株,为进一步研究Crk L在慢性粒细胞白血病中的作用奠定了基础;3、Crk L下调能够抑制CML细胞株K562的增殖、克隆形成、迁移和侵袭、促进细胞凋亡、降低Imatinib mesylate耐药性,将细胞周期阻滞在S期,并促进细胞向巨核细胞分化;4、Crk L下调通过调控多条信号转导通路包括PI3K-Akt/m TOR、MAPK、FAK/Src、Crk L-STAT5和p130CAS/Crk L/Dock180/RAC1来抑制CML的恶性转化。Crk L在慢性粒细胞白血病生物学行为中发挥重要作用,有望成为新的CML基因治疗的分子靶点。
【关键词】：慢性粒细胞白血病 CrkL K562细胞 耐药性 分子机制
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.72
【目录】：

• 中文摘要9-12
• 英文摘要12-15
• 前言15-17
• 第一部分 CrkL表达稳定下调的慢性粒细胞性白血病K562细胞株的建立17-30
• 材料和方法17-23
• 1. 材料17-18
• 1.1 细胞系及培养条件17
• 1.2 主要试剂及仪器17-18
• 2. 方法18-23
• 2.1 载体的构建与验证18-19
• 2.2 CrkL表达稳定下调的慢性粒细胞白血病K562细胞株的建立19-23
• 2.3 统计学分析23
• 结果23-26
• 1. K562细胞转染效率23-24
• 2. Western blot 检测各组单克隆细胞株 CrkL 蛋白水平24
• 3. q RT-PCR 检测各组细胞 CrkL mRNA 水平24-25
• 4. Western blot检测各组单克隆细胞株磷酸化CrkL蛋白水平25-26
• 讨论26-27
• 结论27
• 参考文献27-30
• 第二部分 CrkL对慢性粒细胞性白血病K562细胞恶性行为的影响及分子机制研究30-66
• 材料和方法30-36
• 1. 材料30-32
• 1.1 细胞系及培养条件30
• 1.2 主要试剂及仪器30-32
• 2. 方法32-36
• 2.1 CrkL稳定转染K562细胞形态表征32
• 2.2 台盼蓝计数法测定CrkL下调对K562细胞增殖能力的影响32-33
• 2.3 甲基纤维素半固体培养基培养检测CrkL下调对K562细胞克隆形成能力的影响33
• 2.4 Transwell小室法检测CrkL下调对K562细胞迁移能力的影响33-34
• 2.5 Transwell小室法检测CrkL下调对K562细胞侵袭能力的影响34
• 2.6 流式细胞术检测CrkL下调对K562细胞周期的影响34
• 2.7 CrkL下调对K562细胞Imatinib mesylate耐药性的影响34
• 2.8 Hoechst33258检测CrkL下调对K562细胞Imatinib mesylate诱导凋亡的影响34-35
• 2.9 CrkL下调对K562细胞BCL-X、BCL-2、c-MYC、FAK、STAT5A、STAT5B、p-STAT5、ERK1/2、p-ERK1/2、p-AKT、p-JNK、p-c-JUN、p130CAS、Rac1、Rap1、DOCK180和p-mTOR蛋白表达水平的影响35
• 2.10 CrkL下调对K562细胞MMP2、MMP9、E-cadherin、BCRP、c-SRC、CD41、CD61 mRNA表达水平的影响35-36
• 结果36-55
• 1. CrkL下调对K562细胞亚显微结构的影响36-37
• 2. CrkL下调抑制K562细胞体外增殖能力37
• 3. CrkL下调抑制K562细胞体外克隆形成能力37-38
• 4. CrkL下调抑制K562细胞体外迁移能力38-39
• 5. CrkL下调抑制K562细胞体外侵袭能力39-40
• 6. CrkL下调对K562细胞周期的影响40-41
• 7. CrkL下调对K562细胞凋亡有一定促进作用41-42
• 8. CrkL下调对K562细胞Imatinib mesylate耐药性的影响42-43
• 9. CrkL下调促进K562细胞向巨核系分化43-45
• 10. CrkL下调对K562细胞相关信号通路的影响45-55
• 讨论55-59
• 结论59
• 参考文献59-66
• 综述66-76
• 参考文献71-76
• 致谢76-77

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