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结核分枝杆菌H37Ra热休克蛋白16.3敲除菌株的构建及其对小鼠骨髓来源巨噬细胞功能的影响

发布时间:2025-01-04 06:43
  目的:构建H37Ra Hsp16.3基因敲除菌株以及回补菌株,研究Hsp16.3在H37Ra菌株中的功能,并观察该基因敲除菌株对小鼠骨髓来源巨噬细胞炎性细胞因子表达,趋化功能以及抗原呈递功能的影响。方法:1.通过同源重组技术构建Hsp X基因敲除菌株(MUT);向MUT菌株电转化p MV261-Hsp X质粒构建Hsp X基因敲除回补菌株(COMP)。2.通过对比野生型菌株(WT)、COMP和MUT菌株的菌落特征和生长速率来观察Hsp16.3的缺失对H37Ra菌株的影响。3.构建体外WT、COMP和MUT菌株感染巨噬细胞的潜伏感染模型。在该模型构建成功后继续培养24h和48h,Real-time PCR检测巨噬细胞炎性细胞因子i NOS、IL-6和TNF-α基因表达水平,Western-blot检测i NOS的蛋白表达水平,ELISA检测IL-6和TNF-α蛋白表达水平。4.通过transwell实验检测Hsp16.3对巨噬细胞趋化功能的影响,Real-time PCR检测趋化因子CCL2、CCL3、CCL4、CCL5和CCL12基因表达水平,FCM检测F4/80+CCR1+、F4/80...

【文章页数】:88 页

【学位级别】:硕士

【文章目录】:
中英文缩略词表
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分
    1 材料与方法
        1.1 主要实验材料和试剂
            1.1.1 质粒与菌株
            1.1.2 引物
            1.1.3 培养基及缓冲液配置
            1.1.4 试剂耗材
            1.1.5 仪器耗材
        1.2 实验方法
            1.2.1 培养方法及保存
            1.2.2 p0004s-AES质粒构建
            1.2.3 phAE159-AES质粒构建
            1.2.4 制备噬菌体
            1.2.5 噬菌体裂解液转染待敲除菌株
            1.2.6 制备结核分枝杆菌电转化态
            1.2.7 电击转化结核分支杆菌感受态细胞
            1.2.8 HspX基因缺失菌株以及回补菌株的鉴定
                1.2.8.1 菌株蛋白制备
                1.2.8.2 Western-blot检测菌株Hsp16.3 的表达
                    1.2.8.2.1 试剂配置
                    1.2.8.2.2 实验步骤
            1.2.9 生长曲线的测定
            1.2.10 菌落形态观察
        1.3 统计学方法
    2 结果
        2.1 HspX基因敲除菌株的构建
            2.1.1 基因敲除相关引物设计序列定位
            2.1.2 PCR扩增左右臂
            2.1.3 噬菌粒的构建
            2.1.4 构建分枝杆菌噬菌体
            2.1.5 结核分枝杆菌H37Ra HspX基因敲除菌株(MUT)的构建
        2.2 PCR验证结核分枝杆菌H37Ra HspX基因敲除菌株
        2.3 结核分枝杆菌H37Ra HspX基因回补菌株(COMP)的构建
        2.4 菌株Hsp16.3表达的检测
        2.5 菌株生长曲线测定
        2.6 MUT菌株菌落形态
    3 讨论
第二部分
    1 材料与方法
        1.1 主要实验材料和试剂
            1.1.1 实验动物
            1.1.2 实验试剂
            1.1.3 实验仪器
        1.2 方法
            1.2.1 小鼠骨髓来源巨噬细胞的诱导及培养
            1.2.2 CD4+T细胞提取及刺激
            1.2.3 制作巨噬细胞细胞爬片
            1.2.4 吞噬率检测
            1.2.5 体外潜伏感染模型的构建
            1.2.6 荧光定量PCR检测细胞因子基因表达水平
                1.2.6.1 总RNA的提取
                1.2.6.2 RNA逆转录为cDNA
                1.2.6.3 实时荧光定量PCR引物设计列表
                1.2.6.4 实时荧光定量PCR检测体系及其条件
            1.2.7 ELISA检测巨噬细胞培养上清液中的细胞因子
                1.2.7.1 样品及试剂准备
                1.2.7.2 检测
            1.2.8 Western-blot检测巨噬细胞蛋白表达
            1.2.9 流式细胞术检测巨噬细胞相关分子表达水平
            1.2.10 transwell实验
        1.3 统计学分析
    2 结果
        2.1 BMDM的诱导成熟
        2.2 小鼠骨髓来源巨噬细胞对 MUT 菌株的吞噬率检测
        2.3 小鼠骨髓来源巨噬细胞在不同MOI下受感染情况
        2.4 MUT菌株对小鼠骨髓来源巨噬细胞炎性细胞因子m RNA表达的影响
        2.5 MUT菌株对小鼠骨髓来源巨噬细胞炎性细胞因子表达的影响
        2.6 MUT菌株对小鼠骨髓来源巨噬细胞趋化功能的影响
        2.7 MUT菌株对小鼠骨髓来源巨噬细胞抗原提呈功能的影响
            2.7.1 MUT菌株对小鼠骨髓来源巨噬细胞吞噬体-溶酶体的影响
            2.7.2 MUT菌株对小鼠骨髓来源巨噬细胞MHCⅡ表达的影响
            2.7.3 MUT菌株对小鼠骨髓来源巨噬细胞CIITA及其转录因子表达的影响
            2.7.4 MUT菌株对小鼠骨髓来源巨噬细胞和CD4+T细胞共培养体系中IFN-γ和IL-10 表达的影响
            2.7.5 MUT菌株对小鼠骨髓来源巨噬细胞p-STAT1/p-STAT3表达的影响
        2.8 MUT菌株对小鼠骨髓来源巨噬细胞胞内杀伤功能的影响
    3 讨论
结论
参考文献
综述
    参考文献
致谢
作者简介



本文编号:4023058

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