体外模拟气道杯状细胞内大分子拥挤环境对不同糖基化MUC5AC折叠和聚集的影响

发布时间：2025-01-20 17:44

　　目的:研究大分子拥挤环境对不同糖基化程度的黏蛋白(MUC5AC)在复性过程中折叠和聚集的差异效应。方法:首先将含有目的基因片段的重组质粒转染进HEK293细胞诱导MUC5AC的表达,并用镍离子亲和层析柱纯化目的蛋白。用肽N-糖苷酶F(PNGase F)处理纯化的MUC5AC进行酶切去糖基化,聚丙烯酰胺凝胶检测去糖基化结果。利用蛋白拥挤试剂牛血清白蛋白(BSA)以及多糖拥挤剂聚乙二醇2000(PEG2000)、聚蔗糖70(Ficoll70)和葡聚糖70(Dextran70)在体外模拟生物体内的大分子拥挤环境,设置拥挤试剂质量浓度梯度为50g/L、100 g/L和200 g/L,用不含拥挤试剂的缓冲液作为对照组。将盐酸胍(GdnHCl)诱导变性的去糖基化蛋白(d-MUC5AC)及未去糖基化的天然蛋白(n-MUC5AC)分别加入到上述四种大分子拥挤试剂和对照组缓冲液中复性,25℃条件下用紫外分光光度计连续监测复性过程中各组蛋白在488nm处吸光度的变化。复性终产物离心后测定上清液中可溶性蛋白质浓度,分析不同复性体系中蛋白质的复性产率结果:两种蛋白在质量浓度较高(ρ=200 g/L)的拥挤条件下...

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【部分图文】：

图1重组MUC5AC在HEK293中的表达纯化

重庆医科大学硕士研究生学位论文18P<0.05表示差异具有统计学意义。3结果3.1重组MUC5AC在HEK293细胞中的表达纯化质粒转染72h后，收集转染的细胞，提取细胞总蛋白，然后用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化，流出液经SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色鉴定蛋白纯化结果。S....

图2染色分析MUC5AC去糖基化结果

重庆医科大学硕士研究生学位论文19由40kDa下移至17kDa左右。PAS染色结果显示，仅n-MUC5AC在40kDa处显色，PNGaseF处理后的蛋白未见显色，说明在HEK293细胞中表达的n-MUC5AC进行了N-糖基化修饰，而经PNGaseF糖苷酶消化后糖基基团已基本被去处....

图3不同质量浓度的大分子拥挤试剂对n-MUC5AC复性产率的影响

重庆医科大学硕士研究生学位论文20子拥挤试剂的质量浓度ρ选在50或100g/L时两种蛋白质均能很好的复性，由于生物体内的大分子浓度高达80～400g/L[13-15]，因此后续实验选用ρ=100g/L作为最适质量浓度。图3不同质量浓度的大分子拥挤试剂对n-MUC5AC复性产率的影....

图4.不同质量浓度的大分子拥挤试剂对d-MUC5AC复性产率的影响

重庆医科大学硕士研究生学位论文20子拥挤试剂的质量浓度ρ选在50或100g/L时两种蛋白质均能很好的复性，由于生物体内的大分子浓度高达80～400g/L[13-15]，因此后续实验选用ρ=100g/L作为最适质量浓度。图3不同质量浓度的大分子拥挤试剂对n-MUC5AC复性产率的影....

本文编号：4029458