五种中药注射液对大鼠体外肝微粒体中CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9酶的影响

发布时间：2017-08-04 01:02

  本文关键词：五种中药注射液对大鼠体外肝微粒体中CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9酶的影响

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【摘要】：目的:一、建立高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC),测定大鼠体外肝微粒体中对乙酰氨基酚、1-羟基咪达唑仑和4-羟基双氯芬酸的浓度。二、建立大鼠体外肝微粒体孵育体系。选择非那西丁、咪达唑仑和双氯芬酸分别作为CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9的特异性探针药物,用高效液相色谱法分别测定大鼠肝微粒体孵育后相应的代谢物(对乙酰氨基酚、1-羟基咪达唑仑和4-羟基双氯芬酸)的浓度,得出三种探针药物的酶动力学参数,评价CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9三种酶的活性。三、考察五种中药注射液对大鼠体外肝微粒体中CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9酶的影响。向孵育系统中分别加入不同浓度的丹参川芎嗪注射液、谷红注射液、银杏叶提取物注射液、参麦注射液以及参附注射液,测定探针药物代谢产物对乙酰氨基酚、1-羟基咪达唑仑和4-羟基双氯芬酸的浓度,计算半数抑制浓度IC50,考察五种中药注射液对体外肝微粒体中CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9酶活性的影响。方法:建立和优化高效液相色谱条件:1、测定大鼠肝微粒体中对乙酰氨基酚的浓度:柱温选择30℃,流速设定0.8m L·min-1,Hypersil BDS C18柱(150mm×4.6mm,5μm),检测波长245nm,流动相A为乙腈,B为50.0mmol·L-1 Na2HPO4缓冲液(p H4.5),梯度洗脱;2、测定大鼠肝微粒体中1-羟基咪达唑仑的浓度:柱温选择30℃,流速设定1.0m L·min-1,Hypersil BDS C18柱(150mm×4.6mm,5μm),检测波长230nm;流动相A为乙腈,B为10.0mmol·L-1Na2HPO4缓冲液(p H8.4),梯度洗脱;3、测定大鼠肝微粒体中4-羟基双氯芬酸的浓度:柱温选择30℃,流速设定0.8m L·min-1,Hypersil BDS C18柱(250mm×4.6mm,5μm),检测波长276nm,流动相A为乙腈,B为50.0mmol·L-1 Na2HPO4缓冲液(p H4.5),等度洗脱。优化大鼠肝微粒体孵育体系的蛋白浓度,优化孵育时间。以Lineweaver-Burk为坐标求得Km与Vmax值。将不同浓度的丹参川芎嗪注射液、谷红注射液、银杏叶提取物注射液、参麦注射液以及参附注射液分别加入到孵育体系中,测定探针药物代谢产物的浓度,评价对三种酶活性的影响,并分别计算出五种中药注射液对CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9的半数抑制浓度(IC50)。结果:在建立的色谱条件下,探针药物和代谢产物峰形良好,各自内标亦符合标准,整个体系中干扰因素较小。对乙酰氨基酚的酶动力学参数:Km=102.0μmol·L-1,Vmax=1.05nmol·min-1·mg protein-1;对乙酰氨基酚线性区间0.10~49.90μmol/L。处理回收率85%,日内、日间精密度均10%,稳定性均10%,准确度在85%~115%区间内。1-羟基咪达唑仑的酶动力学参数:Km=57.0μmol·L-1,Vmax=1.05nmol·min-1·mg protein-1;1-羟基咪达唑仑线性区间0.10~29.90μmol/L,处理回收率85%,日内、日间精密度均10%,稳定性均10%,准确度在85%~115%区间内。4-羟基双氯芬酸的酶动力学参数Km=16.9μmol·L-1,Vmax=1.26nmol·min-1·mg protein-1;4-羟基双氯芬酸线性区间0.20~29.90μmol/L,处理回收率85%,日内、日间精密度均10%,稳定性均10%,准确度在85%~115%区间内。丹参川芎嗪注射液对CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9无抑制;谷红注射液对CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9无抑制;银杏叶提取物注射液对CYP3A4和CYP2C9的IC50分别为11.48%、12.91%;参麦注射液对CYP1A2、CYP3A4无抑制,对CYP2C9的IC50为3.68%;参附注射液对CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9的IC50分别为4.27%、6.65%、5.23%。结论:本实验采用体外肝微粒体孵育法,通过探针药物,评价大鼠肝微粒体中CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9酶的活性,方法具有操作性、可靠性。通过建立大鼠肝微粒体孵育体系,考察五种中药注射液对CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9酶活性产生的影响。经数据整理后发现:丹参川芎嗪注射液在体外对CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9无明显抑制作用;谷红注射液在体外对CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9无明显抑制作用;银杏叶提取物注射液在体外对CYP3A4和CYP2C9均有轻度抑制作用;参麦注射液在体外对CYP1A2和CYP3A4无明显抑制作用,对CYP2C9有抑制作用;参附注射液在体外对CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9均有抑制作用。
【关键词】：高效液相色谱法 中药注射液 大鼠肝微粒体 CYP1A2 CYP3A4 CYP2C9
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285.5
【目录】：

• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-15
• 材料和方法15-22
• 2.1 仪器、药品与试剂15-16
• 2.2 肝微粒体的制备16-17
• 2.3 溶液配制17-18
• 2.4 肝微粒体孵育体系18
• 2.5 样品处理18-19
• 2.6 色谱条件19
• 2.7 非那西丁的体外酶动力学测定19-20
• 2.8 咪达唑仑的体外酶动力学测定20
• 2.9 双氯芬酸的体外酶动力学测定20-21
• 2.10五种中药注射液对CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9酶活性影响的测定21-22
• 结果22-35
• 3.1 测定对乙酰氨基酚的方法学确证22-24
• 3.2 测定 1-羟基咪达唑仑的方法学确证24-26
• 3.3 测定 4-羟基双氯芬酸的方法学确证26-28
• 3.4 非那西丁在大鼠肝微粒体中的酶动力学28-29
• 3.5 咪达唑仑在大鼠肝微粒体中的酶动力学29-30
• 3.6 双氯芬酸在大鼠肝微粒体中的酶动力学30-32
• 3.7 五种中药注射液对CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9酶活性的影响32-35
• 讨论35-37
• 结论37-38
• 参考文献38-40
• 综述40-51
• 参考文献48-51
• 致谢51-52

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本文编号：617061