大菱鲆性别决定机制与染色体组工程育种技术的研究

发布时间：2017-10-14 14:21

  本文关键词：大菱鲆性别决定机制与染色体组工程育种技术的研究

  更多相关文章： 大菱鲆 真鲷精子 性别决定 染色体组操作 雌核发育 四倍体

【摘要】：大菱鲆(Scophthalmus maximus)是世界性鲆鲽类养殖良种,养殖范围遍及欧、美、亚洲十几个沿海国家。中国是大菱鲆养殖大国,年产量近6万吨,占世界养殖总产量的80%以上,产业年产值超过50亿元,是北方海水养殖支柱产业,可以说,涉及大菱鲆苗种养殖性状的微小提升都将对产业发展起到级联促进作用。染色体组工程育种技术是鱼类遗传育种和种质改良的重要组成部分,也是研究鱼类性别遗传决定类型的最直接和有效的方法。本研究建立了大菱鲆减数分裂型、有丝分裂型雌核发育和四倍体诱导等染色体组操作技术,明确了大菱鲆性腺分化关键时期及其性别遗传决定机制,为大菱鲆全雌和三倍体苗种产业化培育奠定了基础。主要研究结果如下：(1)大菱鲆减数分裂型雌核发育二倍体的诱导采用正交设计实验方法优化了真鲷冷冻精子诱导大菱鲆减数分裂型雌核发育的诱导条件。结果表明,真鲷精子是诱导大菱鲆卵子胚胎发育的理想刺激源,未经紫外线照射处理的真鲷精子与大菱鲆卵子受精后形成的胚胎,无论是否经过冷休克处理都不能孵化出膜；精液稀释至1/20、厚度0.4mm,经剂量为6480-7200 erg·mm-2紫外线照射处理后的真鲷精子与大菱鲆卵子受精后形成的胚胎,初孵仔鱼表现出典型的单倍体综合征；受精和孵化水温为(14.5±0.5℃)时,大菱鲆减数分裂型雌核发育单倍体的冷休克二倍体化的最佳处理起始时间、处理水温和持续时间分别为受精后6.5 min、-2℃和45 min。至孵化后60口龄,雌核发育苗种的成活率为0.61%,仅相当于其半同胞苗种的10%左右,60-180日龄两者成活率的差异不显著,均达90%以上；14月龄前,雌核发育苗种的全长和体重都比半同胞普通苗种要低,至17月龄时其全长和体重与半同胞对照一致,两者无显著性差异。(2)大菱鲆不同倍性胚胎发育时序和形态的比较研究对真鲷冷冻精液诱导的大菱鲆单倍体、减数分裂型雌核发育二倍体和杂交二倍体,以及同源精子诱导的大菱鲆三倍体和普通二倍体胚胎发育时序和形态进行了比较研究。结果表明,在水温14.5±0.5℃孵化条件下,三倍体和雌核发育二倍体胚胎发育速度一直较普通二倍体为慢,三倍体稍快于雌核发育二倍体；单倍体在囊胚期前胚胎发育速度最快,囊胚期后发育速度逐渐变慢,原肠期发育时间最长；杂交二倍体在尾芽期前胚胎发育速度一直比普通二倍体快,心跳期胚胎发育开始停止,胚胎死亡,不能正常孵出；除杂交二倍体外的各实验组至孵化出膜所需时间和孵化率分别为：普通二倍体109hl5min和83.4±3.02%,三倍体109h30min和44.6±2.40%,雌核发育二倍体112hl5min和42.4±3.54%,单倍体124h40min和4.5±1.91%。各组胚胎发育形态上的差别主要表现为杂交二倍体胚体细长,多数器官分化不全；单倍体胚胎胚体粗短、头突大、脊柱弯曲明显,表现出典型的单倍体综合症；雌核发育二倍体、三倍体与普通二倍体胚胎相比,形态上没有明显差别,但初孵仔鱼畸形率显著增高。(3)大菱鲆有丝分裂型雌核发育二倍体的诱导采用静水压法抑制第一次卵裂,对紫外线灭活的真鲷冷冻精子诱导大菱鲆有丝分裂型雌核发育的实验条件进行了研究。结果表明,在受精和孵化水温为14.5±0.5℃时,静水压法诱导大菱鲆有丝分裂型雌核发育二倍体的最佳处理起始时间、处理压力和持续时间分别为受精后85-90 min、75 MPa和6 min。同一批次受精卵有丝分裂型雌核发育孵化率显著低于减数分裂型雌核发育,胚胎畸形率显著高于后者。规模化诱导的有丝分裂型雌核发育孵化率为1.34%,至40dph成活率为3.25%,40-60 dph成活率为51.08%,均显著低于同期普通二倍体,60-150dph成活率为98.95%,与普通二倍体差异不显著；150 dph时,雌核发育二倍体体重(16.18±11.30 g)和全长(9.18±2.03 cm)均显著低于普通二倍体(33.02±6.23 g和12.24±0.77 cm)；30尾雌核发育苗种在检测的7个微卫星位点基因纯合度为99.52%。(4)大菱鲆同源四倍体的诱导采用静水压法抑制第一次卵裂,对大菱鲆同源四倍体诱导条件进行了研究。结果表明,在受精和孵化水温为14.5±0.5℃时,大菱鲆四倍体诱导的最佳起始时间和处理压力分别为75-80 min和75 MPa。利用获得的最佳诱导条件处理获得了2批次四倍体群体,四倍体诱导组孵化率(16.54%和11.40%)显著低于对照组(71.62%),畸形率(45.79%和64.10%)则显著高于对照组(4.54%),60 dph前成活率(0.43%和0.16%)显著低于对照组(18.95%),60-365 dph成活率(95.48%)则与对照组(95.43%)相当,NORs-Ag染法、染色体核型分析和血红细胞体积测量法分别统计初孵仔鱼期、150 dph和365 dph苗种四倍体率分别为46.67%、5%和4.95%。(5)温度对大菱鲆性别分化的影响及其性别遗传决定类型通过组织切片观察性腺分化情况、统计分析高温诱导性腺分化期稚鱼以及雌核发育稚鱼的性别比例,研究大菱鲆性腺分化起始时期、温度对早期性别决定的影响和性别遗传决定机制。结果表明,稚鱼最小全长37.43 mm(45 dph)时,形成完整卵巢腔,标志着卵巢分化的起始；全长42.83 mm(55 dph)时,形成输精管,标志着精巢分化的起始。平均全长为12.30±1.45 mm(20 dph)20.05±1.24 mm(28 dph)稚鱼,经25℃高温培育和诱导,雄性比例分别为73.43±3.88%、74.40±6.36%,显著偏离1：1的性比,高温对初始平均全长30 mm(40dph)的稚鱼的性别分化无影响,性别比例未偏离1：1。基于规模化雌核发育诱导稚鱼、减数分裂型子代成熟雄鱼与普通雌鱼受精子代苗种性别比例,明确大菱鲆性别遗传决定类型为雌性异配型(ZW♀/ZZ♂)。
【关键词】：大菱鲆 真鲷精子 性别决定 染色体组操作 雌核发育 四倍体
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-16
• 第一章 文献综述16-43
• 第一节 海水鱼类染色体组工程育种技术研究概述16-34
• 1. 海水鱼类雌核发育人工诱导技术研究进展16-30
• 1.1 鱼类雌核发育诱导原理16-17
• 1.2 海水鱼类雌核发育人工诱导技术17-26
• 1.3 海水鱼类雌核发育与性别遗传决定类型的鉴定26-30
• 2. 海水鱼类多倍体诱导技术研究进展30-34
• 2.1 鱼类多倍体诱导原理和方法30-31
• 2.2 鱼类多倍体倍性鉴定方法及应用31-32
• 2.3 海水鱼类多倍体育种研究进展及其应用前景32-34
• 第二节 鲆鲽类性别决定机制及性别分化研究进展34-40
• 1. 鲆鲽类性别决定机制35-38
• 1.1 鲆鲽类性别的遗传决定机制35-36
• 1.2 温度对鲆鲽类性别决定的影响36
• 1.3 自然种群分布纬度变化对鲆鲽类性别决定的影响36-37
• 1.4 生长速度对鲆鲽类性别决定的影响37-38
• 2. 鲆鲽类性别决定机制研究展望38-40
• 第三节 大菱鲆性别决定机制及染色体组操作技术研究进展40-43
• 第二章 大菱鲆减数分裂型雌核发育二倍体的诱导43-57
• 1 材料和方法44-46
• 1.1 大菱鲆卵和真鲷冷冻精子的来源44
• 1.2 受精卵孵化、胚胎发育观察及受精率、孵化率的统计44
• 1.3 真鲷冷冻精子遗传物质失活处理的Hertwig效应试验44-45
• 1.4 大菱鲆减数分裂雌核发育冷休克诱导条件优化45
• 1.5 大菱鲆减数分裂雌核发育诱导效果及倍性检验45
• 1.6 大菱鲆雌核发育苗种的培育及养殖45-46
• 1.7 数据处理46
• 2 结果46-53
• 2.1 真鲷冷冻精子遗传物质失活处理的Hertwig效应46-47
• 2.2 大菱鲆减数分裂雌核发育冷休克诱导条件的优化47-48
• 2.3 真鲷冷冻精子诱导大菱鲆减数分裂雌核发育的效果48-51
• 2.4 大菱鲆减数分裂型雌核发育苗种的培育及养殖51-53
• 3. 讨论53-57
• 第三章 大菱鲆不同倍性胚胎发育时序和形态的比较57-70
• 1 材料和方法57-59
• 1.1 大菱鲆卵和真鲷冷冻精子的来源57
• 1.2 真鲷冷冻精液灭活处理57-58
• 1.3 试验胚胎的获得58
• 1.4 试验胚胎发育观察58
• 1.5 试验胚胎倍性鉴定58-59
• 2 结果59-67
• 2.1 各试验组受精率、孵化率和初孵仔鱼畸形率59-60
• 2.2 各试验组大菱鲆的胚胎发育过程60-66
• 2.3 初孵仔鱼倍性鉴定66-67
• 3 讨论67-70
• 第四章 大菱鲆有丝分裂型雌核发育二倍体的诱导70-87
• 1 材料和方法71-74
• 1.1 大菱鲆卵和真鲷冷冻精子的来源71
• 1.2 真鲷冷冻精子遗传物质灭活的紫外线照射处理方法71
• 1.3 人工受精、受精卵孵化、胚胎发育观察方法71-72
• 1.4 大菱鲆有丝分裂型雌核发育静水压诱导条件的建立72
• 1.5 有丝分裂型雌核发育诱导条件的验证及其与减数分裂型雌核发育的比较72-73
• 1.6 大菱鲆有丝分裂型雌核发育苗种的培育及养殖73-74
• 1.7 数据处理74
• 2 结果74-83
• 2.1 静水压法诱导大菱鲆有丝分裂型雌核发育的实验参数74-77
• 2.2 大菱鲆有丝分裂型和减数分裂型雌核发育诱导的比较研究77-80
• 2.3 大菱鲆有丝分裂型雌核发育的规模化诱导80-83
• 3 讨论83-87
• 第五章 大菱鲆同源四倍体的诱导87-100
• 1 材料和方法88-91
• 1.1 大菱鲆精、卵采集88
• 1.2 受精卵孵化、胚胎发育观察及受精率、孵化率的统计88-89
• 1.3 大菱鲆四倍体静水压法诱导条件的建立及仔鱼倍性鉴定89-90
• 1.4 大菱鲆四倍体苗种的规模化诱导及培育90-91
• 1.5 数据处理91
• 2 结果91-96
• 2.1 静水压法诱导大菱鲆四倍体的实验参数91-93
• 2.2 大菱鲆四倍体的规模化诱导93-96
• 3 讨论96-100
• 第六章 温度对大菱鲆性别分化的影响及其性别遗传决定类型100-115
• 1 材料和方法101-104
• 1.1 大菱鲆性腺分化的组织学研究101-102
• 1.2 温度对大菱鲆性别分化的影响102-104
• 1.3 大菱鲆雌核发育子代苗种的性别比例104
• 1.4 数据分析104
• 2 结果104-111
• 2.1 大菱鲆性腺分化的组织学和细胞学结果104-107
• 2.2 温度对大菱鲆性别分化的影响107-110
• 2.3 大菱鲆雌核发育子代苗种的性别比例110-111
• 3 讨论111-115
• 结果115-116
• 参考文献116-138
• 致谢138-139
• 个人简历139
• 发表的学术论文139-140

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