粉红螺旋聚孢霉67-1菌寄生相关基因的筛选与功能研究

发布时间：2017-10-16 10:26

  本文关键词：粉红螺旋聚孢霉67-1菌寄生相关基因的筛选与功能研究

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【摘要】：粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea,又名粉红粘帚霉Gliocladium roseum)是一类重要的菌寄生真菌,可以防治核盘菌、灰葡萄孢、镰刀菌、立枯丝核菌等引起的多种植物真菌病害,同时还可以促进作物生长,在温室和田间试验中广泛应用,具有巨大的生防潜力。但目前尚未见该菌寄生核盘菌菌核分子机制的报道。为阐明粉红螺旋聚孢霉寄生菌核机制,筛选菌寄生相关基因,本研究以实验室前期分离得到的一株高效粉红螺旋聚孢霉菌株67-1为材料,通过高通量测序技术分别获得了67-1全基因组序列和寄生核盘菌菌核转录组信息,并研究了其脂滴包被蛋白基因per3、几丁质酶基因chi67和单加氧酶基因mono67在寄生菌核过程中的作用。本研究以67-1菌丝为材料,提取基因组DNA后进行全基因组测序和分析。首先构建了三个PE文库(170 bp,300 bp和500 bp)和1个MP文库(5 kb),采用Illumina Hiseq 2500平台进行测序,测序覆盖度大于150×,对序列进行组装后共得到1,552个contigs(重叠群),N50为99,664 bp。这些contigs继续组装形成475个scaffolds,N50为569,489 bp。最终组装信息表明,67-1基因组大小为55.4 Mb,G+C含量为49.2%。通过Fgenesh软件分析,共预测出20,747个基因,与NCBI NR数据库比对,共有13,474个找到同源序列。67-1基因组序列信息为后续研究其与植物病原真菌的互作提供分子基础。为研究粉红螺旋聚孢霉67-1寄生核盘菌菌核分子机制并筛选寄生相关基因,本研究利用高通量测序和实时荧光定量PCR技术筛选获得了67-1寄生核盘菌菌核不同时间间隔(8 h、24 h和48 h)的差异表达基因。转录组测序和分析表明共得到26,351个单值基因,其中有18,525个基因可以注释到NR、KEGG、Swiss-Prot、GO和COG数据库。在3个寄生时间段分别有3,217、4,025和4,274个基因上调表达,2,739、1,249和1,064个基因下调表达。对差异表达基因进行实时荧光定量PCR检测,发现菌核诱导下12个基因明显上调表达,与转录组分析一致,为研究粉红螺旋聚孢霉寄生相关基因提供候选基因。内参基因是应用实时荧光定量PCR精确检测基因表达量的基础。为了筛选67-1寄生菌核过程中稳定表达的内参基因,本研究选择了7个真菌常用的管家基因,18S核糖体蛋白基因(18S r RNA)肌动蛋白基因(Actin),β-微管蛋白基因(β-tubulin),延伸因子基因(Elongation factor),泛素基因(Ubiquitin),泛素结合蛋白基因(Ubiquitin-conjugating enzyme)和甘油3-磷酸脱氢酶基因(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase),通过ge Norm、Bestkeeper和Normfinder三个常用内参基因表达稳定性分析软件进行分析,发现延伸因子基因表达在不同阶段均最为稳定,可以用于67-1寄生核盘菌菌核相关基因的定量。本文通过67-1寄生菌核转录组数据分析,得到一个编码脂滴包被蛋白的基因per3、一个几丁质酶基因chi67和一个单加氧酶基因mono67,这三个基因均在菌核诱导下显著上调表达。通过全基因组信息获得3个基因全长DNA序列。分别对per3和chi67过表达,发现突变菌株对菌核的寄生能力显著提高,16 h达到100%。防治大豆菌核病温室盆栽试验表明,per3转化子6-4防治大豆菌核病效果最好,达到76.5%,比野生菌株和多菌灵分别高23.8%和20.9%。这是脂滴包被蛋白在菌寄生菌中首次作为生防因子的报道。chi67转化子在16 h时对菌核寄生力比野生菌株高130%,对大豆菌核病防效分别比野生菌株和多菌灵高31.7%和28.7%,且产几丁质酶能力是野生菌株的2.4倍。对mono67基因进行敲除验证,利用同源重组原理构建了mono67敲除载体,并成功获得了敲除突变株Δmono67。室内和温室生测表明,Δmono67对核盘菌菌核的侵染起始时间与野生菌株基本一致,但寄生水平由野生菌株的四级降为三级,并且对盆栽大豆菌核病的防效明显下降。相关研究为进一步开发寄生相关基因提供基础。
【关键词】：粉红螺旋聚孢霉 核盘菌 菌寄生相关基因 过表达 基因敲除
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S476.1
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-15
• 英文缩略表15-16
• 第一章 引言16-32
• 1.1 植物真菌病害及防治16-17
• 1.1.1 植物真菌病害16
• 1.1.2 生物防治16-17
• 1.2 菌寄生过程相关基因研究进展17-23
• 1.2.1 菌寄生真菌的种类17
• 1.2.2 菌寄生相关基因的研究手段17-18
• 1.2.3 菌寄生过程相关基因的研究进展18-23
• 1.3 粘帚霉研究进展23-26
• 1.3.1 生物学特性23-24
• 1.3.2 生物防治效果24
• 1.3.3 粘帚霉的生防机制24-25
• 1.3.4 粘帚霉生防基因的筛选与转化25-26
• 1.4 高通量测序技术研究进展26-29
• 1.4.1 高通量测序技术及发展26-28
• 1.4.2 高通量测序技术的应用28-29
• 1.5 内参基因的研究进展29-31
• 1.5.1 内参基因研究的必要性29
• 1.5.2 内参基因满足的条件29
• 1.5.3 常用的内参基因29-30
• 1.5.4 内参基因的筛选方法30-31
• 1.6 本研究的目的和意义31-32
• 第二章 粉红螺旋聚孢霉 67-1 全基因组测序及分析32-44
• 2.1 材料与方法32-36
• 2.1.1 菌株和培养基32
• 2.1.2 67-1 菌丝收集32
• 2.1.3 67-1 DNA提取及质量检测32-33
• 2.1.4 67-1 菌种鉴定33-34
• 2.1.5 基因组文库构建及测序34
• 2.1.6 原始数据处理34-35
• 2.1.7 全基因组数据组装35
• 2.1.8 全基因组基因注释35
• 2.1.9 非编码RNA(nc RNA)预测35
• 2.1.10 67-1 基因家族分析35-36
• 2.2 实验结果36-42
• 2.2.1 样品DNA提取及质量检测36
• 2.2.2 全基因组测序及组装36-39
• 2.2.3 基因注释及分析39-42
• 2.2.4 非编码RNA预测42
• 2.2.5 67-1 基因家族分析42
• 2.3 讨论42-44
• 第三章 粉红螺旋聚孢霉 67-1 寄生核盘菌菌核转录组测序及分析44-65
• 3.1 材料与方法44-51
• 3.1.1 菌株、培养基和培养条件44
• 3.1.2 样品处理44-45
• 3.1.3 RNA提取45-47
• 3.1.4 c DNA文库构建及测序47
• 3.1.5 数据处理47
• 3.1.6 转录组序列组装47
• 3.1.7 转录组Unigene功能注释及分析47-48
• 3.1.8 Unigene表达差异分析48-49
• 3.1.9 Unigene SSR分析49
• 3.1.10 Unigene SNP分析49
• 3.1.11转录组实时荧光定量PCR验证49-51
• 3.2 实验结果51-63
• 3.2.1 样品RNA提取及质量检测51-52
• 3.2.2 转录组测序及组装52-54
• 3.2.3 Unigene功能注释及分析54-58
• 3.2.4 寄生过程差异表达基因的的筛选58-61
• 3.2.5 Unigene SSR分析61
• 3.2.6 Unigene SNP分析61-62
• 3.2.7 实时荧光定量PCR验证62-63
• 3.3 讨论63-65
• 第四章 粉红螺旋聚孢霉 67-1 寄生核盘菌菌核内参基因筛选65-71
• 4.1 材料与方法65-67
• 4.1.1 菌株、培养基和培养条件65
• 4.1.2 菌核诱导处理65
• 4.1.3 RNA提取和c DNA第一链合成65
• 4.1.4 内参基因的扩增65-66
• 4.1.5 内参基因表达稳定性研究66
• 4.1.6 丝氨酸蛋白酶基因的表达分析66-67
• 4.2 实验结果67-70
• 4.2.1 内参基因引物特异性扩增67
• 4.2.2 内参基因表达丰度分析67-68
• 4.2.3 内参基因表达稳定性分析68-69
• 4.2.4 丝氨酸蛋白酶基因sep表达水平分析69-70
• 4.3 讨论70-71
• 第五章 粉红螺旋聚孢霉 67-1 转脂滴包被蛋白基因功能研究71-84
• 5.1 材料与方法71-76
• 5.1.1 菌株、培养基和培养条件71
• 5.1.2 菌核诱导下粉红螺旋聚孢霉 67-1 per3表达量检测71-72
• 5.1.3 per3全长克隆72
• 5.1.4 per3生物信息学分析72-73
• 5.1.5 per3过表达载体构建73-74
• 5.1.6 per3过表达载体的转化74-75
• 5.1.7 转化子的筛选及生物学特性75
• 5.1.8 转化子对大豆核盘菌菌核寄生性测定75
• 5.1.9 转化子盆栽防治大豆菌核病试验75-76
• 5.1.10 转化子per3表达量测定76
• 5.1.11 统计分析76
• 5.2 实验结果76-83
• 5.2.1 菌核诱导下粉红螺旋聚孢霉 67-1 per3表达水平76-77
• 5.2.2 per3基因克隆与特性77-78
• 5.2.3 p AN71per3载体构建78
• 5.2.4 per3转化子的筛选和生物学性状78-79
• 5.2.5 转化子对大豆核盘菌菌核寄生性测定79-81
• 5.2.6 转化子per3表达量测定81
• 5.2.7 转化子盆栽防治大豆菌核病试验81-83
• 5.3 讨论83-84
• 第六章 粉红螺旋聚孢霉 67-1 转几丁质酶高效工程菌株的构建84-96
• 6.1 材料与方法84-87
• 6.1.1 菌株、培养基和培养条件84
• 6.1.2 菌核诱导下粉红螺旋聚孢霉 67-1 chi67表达量检测84
• 6.1.3 chi67全长克隆84-85
• 6.1.4 chi67生物信息学分析85
• 6.1.5 chi67过表达载体的构建85-86
• 6.1.6 chi67过表达载体的转化86
• 6.1.7 转化子的筛选及生物学特性86
• 6.1.8 转化子对大豆核盘菌菌核寄生性测定86-87
• 6.1.9 转化子几丁质酶活性测定87
• 6.1.10转化子chi67表达量测定87
• 6.1.11转化子盆栽防治大豆菌核病试验87
• 6.1.12统计分析87
• 6.2 实验结果87-95
• 6.2.1 菌核诱导下粉红螺旋聚孢霉 67-1 chi67表达水平87-88
• 6.2.2 chi67基因克隆与特性88-89
• 6.2.3 p AN71chi67转化载体构建89-90
• 6.2.4 chi67转化子的筛选和生物学研究90-91
• 6.2.5 转化子对大豆核盘菌菌核寄生性测定91-92
• 6.2.6 转化子几丁质酶活测定92-93
• 6.2.7 转化子chi67表达量测定93
• 6.2.8 转化子盆栽防治大豆菌核病试验93-95
• 6.3 讨论95-96
• 第七章 粉红螺旋聚孢霉 67-1 单加氧酶基因功能研究96-105
• 7.1 材料与方法96-99
• 7.1.1 菌株、培养基和培养条件96
• 7.1.2 菌核诱导下粉红螺旋聚孢霉 67-1 mono67表达量检测96-97
• 7.1.3 mono67全长克隆97
• 7.1.4 mono67生物信息学分析97
• 7.1.5 mono67敲除载体的构建97-98
• 7.1.6 mono67敲除载体的转化98-99
• 7.1.7 阳性转化子的筛选与验证99
• 7.1.8 转化子对大豆核盘菌菌核寄生性测定99
• 7.1.9 转化子盆栽防治大豆菌核病试验99
• 7.1.10 统计分析99
• 7.2 实验结果99-103
• 7.2.1 菌核诱导下粉红螺旋聚孢霉 67-1 mono67表达水平99-100
• 7.2.2 mono67基因克隆与特性100
• 7.2.3 pUC19-mono67敲除载体的构建100-101
• 7.2.4 转化子的筛选101
• 7.2.5 转化子对大豆核盘菌菌核寄生性测定101-102
• 7.2.6 转化子盆栽防治大豆菌核病试验102-103
• 7.3 讨论103-105
• 第八章 全文结论105-106
• 参考文献106-120
• 致谢120-121
• 作者简历121

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

1 刘富平,朱天辉;绿粘帚霉诱变生物型(GVD)对三种病原真菌的拮抗作用[J];四川林业科技;2002年04期

2 程晓凤;黄福江;刘明典;汪登强;;454测序技术开发微卫星标记的研究进展[J];生物技术通报;2011年08期

3 张得芳;马秋月;尹佟明;夏涛;;第三代测序技术及其应用[J];中国生物工程杂志;2013年05期

4 马桂珍;高会兰;张拥华;李世东;谢丙炎;;链孢粘帚霉几丁质酶的诱导及其抗真菌活性研究[J];微生物学通报;2007年05期

5 马炳田,文成敬;几种核盘菌菌核重寄生真菌生物防治潜能的研究[J];中国农学通报;2002年06期

6 高俊明;马丽娜;李欣;韩巨才;;盾壳霉对核盘菌的拮抗作用研究[J];植物保护;2006年06期

7 张拥华,高会兰,马桂珍,李世东*;粉红粘帚霉67-1菌株寄生核盘菌研究[J];植物病理学报;2004年03期

8 王艳玲;胡鹏杰;李二伟;刘杏忠;车永胜;刘钢;;农杆菌介导的粘帚菌遗传转化[J];微生物学报;2013年11期

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 熊丽东;红花转录组测序分析及其油体蛋白全长的获得[D];吉林农业大学;2011年

2 钟增明;链孢粘帚霉HL-1-1寄生核盘菌菌核相关基因的分离鉴定[D];中国农业科学院;2010年

，

本文编号：1042176