PeHSF激活PeWRKY1调控胡杨耐盐机制研究

发布时间：2017-10-17 05:22

  本文关键词：PeHSF激活PeWRKY1调控胡杨耐盐机制研究

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【摘要】：在盐胁迫条件下,胡杨(Populus euphratica)通过复杂的信号调控网络来调控胞内离子平衡和活性氧平衡。微阵列分析结果表明,与盐敏感的群众杨相比,胡杨在NaCl胁迫下除了能上调部分离子平衡以及活性氧平衡相关基因,还能够迅速诱导与逆境胁迫信号转导相关的转录调节因子如WRKY、MYB、 HSF(热激转录因子)的表达。将胡杨逆境胁迫关键转录因子PeHSF和PeWRK Y1基因分别转化到烟草中,对转基因植株在盐胁迫下的表型进行鉴定,并深入探讨了胡杨PeHSF和PeWRKY1的相互关系及其在耐盐性中的作用。主要实验结果与结论如下：胡杨PeHSF对植物ROS平衡的调控作用。实验结果表明：在胡杨叶片和愈伤细胞中,PeHSF的mRNA水平都呈现出了随NaCl(150mM)胁迫时间的延长而呈现规律变化：在盐处理后即被激发,到达峰值,然后回落。而在DPI(质膜NADPH抑制剂)和LaCl3(质膜钙通道抑制剂)存在下,mlRNA表达量却受到抑制,表明PeHSF在盐胁迫下受到H202和Ca2+信号激活。对转基因烟草幼苗进行盐处理,发现过表达PeHSF基因可以提高烟草种子萌发率、促进根系生长；随后研究证明耐盐性的提高归结于抗氧化系统的增强；进一步研究发现与野生型植株相比,转基因株系体内活性氧在盐胁迫下能够得到有效清除,而且转基因株系中的APX、GR、GPX转录水平和酶活力与野生型相比,都得到了提高。胡杨PeWRKY1对植物离子平衡的调控作用。与野生型烟草相比,转PeWRKY1基因烟草植株无论是种子存活率还是根系生长都显示出对盐胁迫更强的适应性。离子流数据显示：短期盐胁迫处理(100mmol/L NaCl、24 h)后,转基因型烟草Na+外流升高,钾离子出现明显的内流。而野生型烟草Na+却出现内流、钾离子外流立即升高,并在一定的水平保持一段的时间。PeHSF激活PeWRKY1调控胡杨耐盐性的机制。通过对所克隆得到的胡杨PeWRKYl的全长基因序列进行比对分析,发现胡杨PeWRKY1与灰杨PcWRKY1高度一致(95%)；通过genomic walking技术得到胡杨PeWRKYl和盐敏感杨树灰杨(Populus × canescens) PcWRKYl基因编码区上游启动子序列。经过序列比对,发现胡杨PeWRKY1转录因子的启动子区域(PeWRKY1-pro)与盐敏感的毛果杨、灰杨具有显著差异。主要体现在：胡杨PeWRKY1启动子区含有多个热激元件(HSEs)串联重复、呈簇状存在。酵母单杂交结果显示,胡杨PeHSF可以和PeWR KY1启动子区的HSE元件相结合。为了验证HSE元件是否参与调节盐胁迫下PeWRKY1的表达,分别将PeWRKY1-pro::GUS 和 PcWRKY1-pro::=GUS共同转化烟草,进行盐处理。GUS显色结果显示,在转化PeWRKY1-pro::GUS的烟草中,根、茎、叶同时显示出GUS高活性,而在PcWRKY1-pro::GUS中并不明显。在盐处理的胡杨中,利用烟草脆裂病毒(TRV)诱导eHSF沉默后,PewRKY1的表达量也随之下降,从而证明在NaCl胁迫下PeWRKY1的表达受PeHSF的调控。综上,胡杨热激蛋白转录因子在盐诱导的H2O2和胞质Ca2+激发下,通过提高胡杨抗氧化酶活性,降低了体内ROS水平以抵御盐诱导的氧化伤害。另一方面,胡杨PeHSF在盐胁迫下可以与PeWRKYl启动子区HSE元件相结合,调控PeWRKYl的表达,调控离子平衡,进而抵御盐诱导的离子伤害。
【关键词】：PeHSF PeWRKY1 PeWRKY1启动子 基因沉默 盐胁迫
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S792.11
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 缩略词(Abbreviation)12-13
• 引言13-15
• 1. 文献综述15-25
• 1.1 胡杨离子平衡和活性氧平衡的调控机制15-17
• 1.1.1 胡杨离子平衡调控机制15-17
• 1.1.2 胡杨活性氧平衡调控机制17
• 1.2 热激蛋白转录因子及其研究进展17-21
• 1.2.1 HSF的结构特征18
• 1.2.2 植物HSF的多样性18-20
• 1.2.3 植物HSF的相互作用20
• 1.2.4 植物HSF的特异性20-21
• 1.3 WRKY转录因子及其研究进展21-24
• 1.3.1 WRKY转录因子的结构特征21-22
• 1.3.2 WRKY家族成员调控植物生物胁迫及其信号转导22
• 1.3.3 WRKY家族成员调控植物非生物胁迫及其信号转导22-24
• 1.4 研究思路24-25
• 2. 胡杨热激蛋白转录因子PeHSF调控活性氧平衡25-49
• 2.1 HSF的转录活性分析26-34
• 2.1.1 实验原理26
• 2.1.2 实验材料26-27
• 2.1.2.1 植物材料26
• 2.1.2.2 菌株、质粒与试剂26-27
• 2.1.3 实验方法27-30
• 2.1.3.1 胡杨PeHSF基因的克隆及生物信息学分析27-28
• 2.1.3.2 胡杨PeHSF转录激活功能验证28-30
• 2.1.4 实验结果30-34
• 2.1.4.1 胡杨PeHSF蛋白序列分析30-33
• 2.1.4.2 胡杨PeHSF转录激活活性的验证33-34
• 2.2 PEHSF耐盐性功能分析34-40
• 2.2.1 实验材料34
• 2.2.1.1 植物材料34
• 2.2.1.2 试剂34
• 2.2.2 实验方法34-35
• 2.2.2.1 胡杨PeHSF过表达烟草植株的鉴定34-35
• 2.2.2.2 转基因烟草的T1代耐盐性分析35
• 2.2.3 实验结果35-39
• 2.2.3.1 PeHSF转基因烟草的PCR与RT-PCR鉴定35-36
• 2.2.3.2 PeHSF转基因烟草在盐胁迫下的表型差异36-38
• 2.2.3.3 PeHSF转基因烟草在盐胁迫下Na~+、K~+、Ca~(2+)浓度的变化38-39
• 2.2.4 小结39-40
• 2.3 盐胁迫下PEHSF调控植物活性氧平衡40-44
• 2.3.1 实验材料40
• 2.3.1.1 植物材料40
• 2.3.2 实验方法40-41
• 2.3.2.1 抗氧化酶活力的测定40-41
• 2.3.2.2 抗氧化酶基因转录水平测定41
• 2.3.3 实验结果41-43
• 2.3.4 小结43-44
• 2.4 PEHSF响应盐胁迫的信号通路44-48
• 2.4.1 实验材料44
• 2.4.1.1 植物材料44
• 2.4.1.2 试剂44
• 2.4.2 实验方法44-45
• 2.4.2.1 RT-PCR检测HSF表达模式44
• 2.4.2.2 检测烟草植株的内源H_2O_244-45
• 2.4.3 实验结果45-47
• 2.4.4 小结47-48
• 2.5 讨论48-49
• 3. PeHSF激活PeWRKY1调控胡杨离子平衡49-95
• 3.1 PEWRKY1与PCWRKY1表达模式比较51-58
• 3.1.1 实验材料51
• 3.1.1.1 植物材料51
• 3.1.1.2 菌株、质粒与试剂51
• 3.1.2 实验方法51-53
• 3.1.2.1 胡杨PeWRKY1灰杨PcWRKY1序列克隆及生物信息学分析51-52
• 3.1.2.2 胡杨PeWRKY1灰杨PcWRKY1表达模式分析52-53
• 3.1.3 实验结果53-58
• 3.1.3.1 PeWRKY1和PcWRKY1生物信息学分析53-56
• 3.1.3.2 PeWRKY1和PcWRKY1表达模式比较56-58
• 3.2 PEWRKY1耐盐性功能分析58-65
• 3.2.1 实验材料58
• 3.2.1.1 植物材料58
• 3.2.1.2 菌株、质粒与试剂58
• 3.2.2 实验方法58-59
• 3.2.2.1 转基因烟草在盐胁迫下的表型58
• 3.2.2.2 转基因烟草在盐胁迫下生理指标测定58-59
• 3.2.3 实验结果59-64
• 3.2.3.1 耐盐性表型分析59-61
• 3.2.3.2 PeWRKY1转基因烟草在盐胁迫下的光合参数变化61
• 3.2.3.3 PeWRKY1转基因植株在盐胁迫下根尖K~+、Na~+离子流的变化61-64
• 3.2.4 讨论64-65
• 3.3 PEWRKY1和PCWRKY1启动子分析65-72
• 3.3.1 实验材料65
• 3.3.1.1 植物材料65
• 3.3.1.2 实验试剂与菌种65
• 3.3.1.3 实验仪器65
• 3.3.2 实验方法65-67
• 3.3.2.1 胡杨PeWRKY1和灰杨PcWRKY1启动子的克隆及生物信息学分析65
• 3.3.2.2 胡杨PeWRKY1和灰杨PcWRKY1启动子表达载体的构建65-66
• 3.3.2.3 PeWRKY1和PcWRKY1启动子表达差异分析66-67
• 3.3.3 实验结果67-71
• 3.3.3.1 PeWRKY1和PcWRKY1启动子序列生物信息学分析67-69
• 3.3.3.2 PeWRKY1和PcWRKY1启动子表达差异性分析69-71
• 3.3.4 小结71-72
• 3.4 PEHSF和PEWRKY1亚细胞定位72-77
• 3.4.1 实验材料72
• 3.4.1.1 植物材料72
• 3.4.1.2 载体与菌株72
• 3.4.1.3 实验试剂72
• 3.4.2 实验方法72-75
• 3.4.2.1 定位载体的构建72-73
• 3.4.2.2 基因枪转化洋葱表皮细胞73-74
• 3.4.2.3 PEG转化原生质体74-75
• 3.4.3 实验结果75-77
• 3.5 胡杨PEHSF与PEWRKY1启动子(PEWRKY1-PRO)HSE序列的相互作用77-95
• 3.5.1 酵母杂交77-84
• 3.5.1.1 实验原理77-78
• 3.5.1.2 实验材料78-79
• 3.5.1.3 实验方法79-80
• 3.5.1.4 实验结果80-83
• 3.5.1.5 小结83-84
• 3.5.2 TRV病毒诱导基因沉默84-95
• 3.5.2.1 病毒诱导基因沉默原理84-85
• 3.5.2.2 实验材料85-86
• 3.5.2.3 实验方法86-88
• 3.5.2.4 实验结果88-94
• 3.5.2.5 小结94-95
• 4. 结论95-97
• 5. 展望97-99
• 参考文献99-111
• 个人简介111-113
• 博士在读期间成果清单113-115
• 导师简介115-117
• 致谢11

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1 申泽丹;PeHSF激活PeWRKY1调控胡杨耐盐机制研究[D];北京林业大学;2015年

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本文编号：1047041