转cry2A和cry1C基因水稻对意大利蜜蜂的生态安全性

发布时间：2017-10-17 10:45

  本文关键词：转cry2A和cry1C基因水稻对意大利蜜蜂的生态安全性

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【摘要】：蜜蜂是重要的经济和社会性昆虫,其作为重要的指示性物种被用于转基因抗虫植物环境安全评估中。本研究系统地评价了分别表达Cry2A和Cry1C蛋白的两种抗虫转基因水稻新品系T2A-1和T1C-19对意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)幼虫和成虫的潜在影响。获得研究结果如下:1.基于已报道的幼虫人工饲料及饲喂方法,本研究发展了一种简单、灵敏的评价转基因杀虫蛋白对幼虫直接毒性影响的试验技术,并采用已知对蜜蜂幼虫具有毒性的大豆胰蛋白酶抑制剂SBTI作为阳性化合物,验证了所发展试验体系的有效性和灵敏性。2.采用所构建的试验体系,评价了取食高剂量的Cry2A及Cry1C蛋白对意蜂幼虫的潜在毒性,并以SBTI为阳性对照,牛血清蛋白BSA为阴性对照。结果显示:分别取食混入纯Cry1C(50μg/g)、Cry2A(400μg/g)或BSA(400μg/g)的人工饲料后,2日龄幼虫的存活率和生长发育没有受到影响;且中肠内总蛋白酶、类胰蛋白酶、氨肽酶和α-乙酸萘酯酯酶活性也没有显著变化;组织切片显示幼虫中肠表皮膜没有受到破坏。而取食了含有SBTI(1 mg/g)的人工饲料后,2日龄幼虫的存活率显著下降,发育历期显著延长;中肠主要蛋白酶和解毒酶的活性也受到显著影响。通过PCR-DGGE分析也没有发现Cry2A(400μg/g)及Cry1C(50μg/g)蛋白对肠道细菌群落的结构产生显著影响。本试验结果说明了意大利蜜蜂幼虫对这两种Cry蛋白不敏感。3.评价了两种转基因抗虫水稻品系T2A-1和T1C-19花粉对意大利蜜蜂幼虫的潜在影响。分别将T2A-1和T1C-19水稻花粉按照0.5%(w:w)的比例直接添加至人工饲料中饲喂2日龄幼虫,发现虽然取食Bt花粉对蜜蜂幼虫中肠蛋白酶和解毒酶的生物活性有一定影响,但对蜜蜂幼虫的生命表参数如存活率、发育历期和老熟幼虫体重没有显著影响。4.将纯Cry2A和Cry1C蛋白分别以400μg/g和50μg/g的浓度加入到50%糖水中饲喂意蜂成蜂,并以SBTI(1 mg/g和10 mg/g)为阳性对照,BSA(400μg/g)为阴性对照,50%糖水为空白对照。饲喂试验持续5周后,在Cry1C、Cry2A或BSA处理中,成蜂存活率和王浆腺腺泡直径均没有受到显著影响;中肠内的总蛋白酶、类胰蛋白酶、氨肽酶和α-乙酸萘酯酯酶活性均没有显著变化。而高浓度SBTI处理的成蜂存活率明显下降;低浓度SBTI处理中成蜂的存活率降低,王浆腺腺泡直径明显减小,且中肠主要酶活性也发生显著变化。PCR-DGGE分析显示:分别取食Cry2A和Cry1C蛋白5天、10天和15天后,意大利蜜蜂成蜂中肠的菌群结构也无明显变化。5.将水稻花粉、蜂蜜、水按5:4:1混匀饲喂意大利蜜蜂成蜂10天后,发现取食Bt水稻花粉的成虫存活率、王浆腺发育、中肠主要蛋白酶和解毒酶的活性与取食非Bt花粉意蜂相比均无显著差异。6.本研究试验结果说明:种植转基因抗虫水稻T2A-1和T1C-19不会对意大利蜜蜂带来影响。
【关键词】：转Bt基因水稻 意大利蜜蜂 生态安全 非靶标影响 PCR-DGGE
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S511;S891.5
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-13
• 英文缩略表13-14
• 第一章 引言14-24
• 1.1 转基因作物的发展现状14-17
• 1.1.1 转基因作物种植情况14-16
• 1.1.2 转基因抗虫水稻研究进展16-17
• 1.2 抗虫转基因作物风险评价程序17
• 1.3 抗虫转基因植物对蜜蜂类影响的研究进展17-23
• 1.3.1 蜜蜂类昆虫概述17-18
• 1.3.2 对生长发育影响的研究18-20
• 1.3.3 对中肠酶活性影响的研究20-21
• 1.3.4 对肠道微生物影响的研究21-22
• 1.3.5 对蜜蜂行为的影响22-23
• 1.4 研究背景、内容及意义23-24
• 1.4.1 研究背景23
• 1.4.2 研究内容23
• 1.4.3 研究意义23-24
• 第二章 Bt蛋白对意大利蜜蜂幼虫的潜在影响24-37
• 2.1 材料和方法24-25
• 2.1.1 供试昆虫24
• 2.1.2 供试试剂24-25
• 2.1.3 主要仪器25
• 2.2 试验内容25-29
• 2.2.1 意大利蜜蜂幼虫人工饲料制备25-26
• 2.2.2 意蜂幼虫人工饲养方法26
• 2.2.3 蜜蜂幼虫取食不同浓度SBTI的生物学反应26
• 2.2.4 Bt蛋白对蜜蜂幼虫的毒性影响26-29
• 2.2.4.1 蜜蜂幼虫生命表参数观察26-27
• 2.2.4.2 蜜蜂幼虫Bt蛋白摄取量检测27
• 2.2.4.3 Cry蛋白的生物活性检测27
• 2.2.4.4 取食Cry蛋白对蜜蜂幼虫消化道酶活性影响27-28
• 2.2.4.5 组织病理学试验28-29
• 2.3 数据分析29
• 2.4 结果与分析29-35
• 2.4.1 蜜蜂幼虫对SBTI的剂量反应29
• 2.4.2 Bt蛋白对蜜蜂幼虫的毒性29-35
• 2.4.2.1 生命表参数影响29
• 2.4.2.2 蜜蜂幼虫Bt蛋白的摄取量29-32
• 2.4.2.3 Bt蛋白生物活性32
• 2.4.2.4 蜜蜂幼虫肠道酶活性32-34
• 2.4.2.5 Cry蛋白对蜜蜂幼虫组织病理学影响34-35
• 2.5 讨论35-37
• 第三章 两种Bt水稻花粉对意大利蜜蜂幼虫的潜在影响37-43
• 3.1 材料和方法37-38
• 3.1.1 供试昆虫37
• 3.1.2 供试试剂37-38
• 3.1.3 供试仪器38
• 3.1.4 供试花粉38
• 3.2 试验内容38-39
• 3.2.1 意大利蜜蜂幼虫花粉  人工饲料的制备38-39
• 3.2.2 生命表参数试验39
• 3.2.3 意蜂幼虫对Bt蛋白的摄取量测定39
• 3.2.4 酶活测定试验39
• 3.3 统计分析39
• 3.4 结果分析39-41
• 3.4.1 生命表参数39-40
• 3.4.2 蜜蜂幼虫对Bt蛋白的摄取量40
• 3.4.3 意大利蜜蜂幼虫肠道酶活性测定40-41
• 3.5 讨论41-43
• 第四章 Bt蛋白及Bt花粉对意大利蜜蜂成虫的毒性影响43-57
• 4.1 材料方法43-44
• 4.1.1 供试昆虫43
• 4.1.2 供试花粉43-44
• 4.1.3 供试试剂44
• 4.2 Bt纯蛋白试验44-45
• 4.2.1 工蜂存活率测定44
• 4.2.2 王浆腺腺泡直径测定试验44-45
• 4.2.3 意蜂中肠酶活性测定试验45
• 4.2.4 Bt蛋白摄取量分析45
• 4.3 Bt花粉试验45-46
• 4.3.1 存活率测定试验45-46
• 4.3.2 王浆腺腺泡直径测定试验46
• 4.3.3 意蜂中肠酶活性测定试验46
• 4.3.4 Bt蛋白摄取量测定46
• 4.4 数据分析46
• 4.5 结果与分析46-55
• 4.5.1 Bt纯蛋白试验结果46-51
• 4.5.2 Bt花粉试验51-55
• 4.6 讨论55-57
• 第五章 Bt蛋白对意大利蜜蜂肠道微生物的影响57-76
• 5.1 材料方法57-58
• 5.1.1 供试昆虫57
• 5.1.2 供试花粉57
• 5.1.3 供试试剂57
• 5.1.4 主要仪器57-58
• 5.2 试验内容58-60
• 5.2.1 意大利蜜蜂的饲喂58
• 5.2.2 样品DNA的提取及检测58
• 5.2.3 PCR扩增58-59
• 5.2.4 DGGE图谱分析59-60
• 5.2.5 16S rRNA基因文库与测序60
• 5.3 结果分析60-74
• 5.3.1 意大利蜜蜂幼虫肠道细菌群落结构检测60-64
• 5.3.1.1 DNA提取结果及PCR扩增结果60-61
• 5.3.1.2 DGGE图谱分析结果61-62
• 5.3.1.3 DGGE图谱条带克隆测序结果分析62-64
• 5.3.2 意大利蜜蜂成虫中肠细菌群落结构检测64-74
• 5.3.2.1 DNA提取结果及PCR扩增结果64-66
• 5.3.2.2 DGGE图谱分析结果66-68
• 5.3.2.3 DGGE图谱条带克隆测序结果分析68-74
• 5.5 讨论74-76
• 第六章结论76-78
• 6.1 结论76-77
• 6.2 创新点77
• 6.3 展望77-78
• 参考文献78-88
• 致谢88-89
• 个人简历89-90

【参考文献】

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本文编号：1048420