棉花雄性不育及黄萎病菌诱导相关microRNA的表达分析

发布时间：2017-11-01 04:21

  本文关键词：棉花雄性不育及黄萎病菌诱导相关microRNA的表达分析

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【摘要】：MicroRNA(miRNA)是一类在真核生物体内普遍存在的、长度约为19~25nt的内源性非编码单链小RNA。近年来研究发现,mi RNA作为基因表达中的一类负调控子,不仅能够调控植物花器官的发育,而且在植物感受逆境胁迫而做出适应性调整的过程中也发挥着重要的作用。因此探讨miRNAs在雄性不育和抗黄萎病中的调控机制,可以为雄性不育在棉花杂种优势上的利用和棉花抗病育种提供新的途径。本研究利用miRNA芯片、高通量测序和实验验证相结合的方法,鉴定棉花中的miRNAs及其靶基因,探讨这些miRNAs在雄性不育和抗黄萎病中的调控机制。分析雄性不育相关以及胁迫诱导条件下棉花miRNA的差异表达情况,探讨差异表达miRNA在花粉发育过程和抗逆反应中所起的作用,为阐明棉花雄性不育的分子机理和抗黄萎病的调控途径提供参考。主要结果如下:1.通过比较不育株和可育株花器官形态发现,不育株花较小,雄蕊花丝极短、花药不开裂,花粉完全败育。在普通生物显微镜下观察发现不育株花粉在花粉母细胞的减数分裂时期出现异常,单核期开始出现大量小孢子裂解,花药发育的全过程中均出现了小孢子裂解现象。2.分别提取不育株和可育株花粉造孢细胞时期、花粉母细胞时期和花粉粒时期花蕾RNA进行microRNA芯片杂交试验,结果显示,在不育株花粉发育的三个时期,分别检测到407、369、401条miRNAs,在可育株花粉发育的三个时期,分别检测到146、286、343条miRNAs。其中,有54条miRNAs在不育株和可育株花粉中达到了显著差异表达水平。另外,利用生物信息学方法预测得到35个miRNA的靶基因,其中大多数靶基因属于转录因子,它们可能在花粉发育过程中发挥着重要的调控作用。3.为了检测miRNA的靶基因在转录水平上的表达状况,利用Solexa测序对棉花“21A”不育株和可育株花粉母细胞时期花蕾进行基因表达谱分析,我们共得到1,742条显著差异表达的基因,其中有12个转录因子参与到花粉发育。通过对差异表达基因的途径显著性富集分析,鉴定了差异表达基因参与花粉发育过程中的主要代谢途径,例如,戊糖和葡萄糖醛酸酯转换途径、类单萜类生物合成途径、、倍半萜类生物合成途径、淀粉蔗糖代谢途径、半乳糖苷酶代谢途径、亚麻酸代谢途径、过氧物酶体代谢途径等。miR159、miR319、miR172等家族miRNAs的靶基因(MYB、AP2等)在转录水平上出现显著差异表达,它们可能参与了基因转录、激素信号转导等代谢调控途径。4.为了研究雄性不育相关miRNA在抗病反应中的作用,以高抗黄萎病品种海岛棉7124和易感品种冀棉11为材料,对棉花进行黄萎病菌胁迫处理,利用高通量Solexa测序和生物信息学分析,鉴定得到140个已知miRNA和58个novel miRNA;筛选出了两种棉花材料之间以及在不同处理条件下中差异表达的miRNA。共有26和19个miRNA在海岛棉7124和冀棉11中受黄萎病菌侵染后诱导表达差异显著,在正常生长和黄萎病菌浸染条件下,分别有35个和38个miRNA在两种棉花栽培种之间表达量有显著差异。其中,在花粉发育过程中起重要调控作用的miR156、miR172、miR399、miR414等家族的miRNAs参与了棉花抗黄萎病反应过程。5.以高抗黄萎病品种海岛棉7124和易感品种冀棉11为材料,对棉花进行黄萎病菌胁迫处理,利用降解组测序测序方法,鉴定得到棉花中107个miRNAs的靶基因,其中,SBP and SPL transcription factor、NAC domain-containing protein、Class III HD-Zip protein、AP2-like factor、F-box/RNI-like superfamily protein和growth-regulating factor(GRF)、MYB转录因子、leucine-rich repeat(LRR)-containing protein和LRR and NB-ARC domain-containing disease resistance-like protein等靶基因在棉花胁迫信号转导和抵御黄萎病菌侵染过程中发挥着重要的调控作用。
【关键词】：核雄性不育系 microRNAs 靶基因 黄萎病 棉花
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S562;S435.621.2
【目录】：

• 中文摘要10-12
• Abstract12-14
• 1 引言14-27
• 1.1 植物雄性不育系的类型14
• 1.2 棉花核雄性不育分子机理的研究14-16
• 1.2.1 棉花核雄性不育基因的定位14-15
• 1.2.2 棉花核雄性不育相关基因的克隆与表达分析15-16
• 1.3 棉花细胞质雄性不育分子机理研究进展16-18
• 1.3.1 细胞质雄性不育分子机理及应用16-17
• 1.3.2 育性恢复机理研究17-18
• 1.4 棉花光温敏雄性不育分子机理研究进展18-19
• 1.4.1 温敏雄性不育18
• 1.4.2 光敏雄性不育18
• 1.4.3 光温互作型雄性不育18-19
• 1.5 植物microRNA的研究19-20
• 1.5.1 植物miRNA的产生19
• 1.5.2 miRNA的作用机制19-20
• 1.6 植物开花及花器官发育相关的miRNA20-21
• 1.7 植物逆境胁迫响应的miRNA21-26
• 1.7.1 miRNA与植物非生物胁迫23-25
• 1.7.1.1 miRNA与养分胁迫23-24
• 1.7.1.2 miRNA与低温胁迫24
• 1.7.1.3 miRNA与干旱胁迫24-25
• 1.7.1.4 miRNA与盐胁迫25
• 1.7.1.5 miRNA与其它非生物胁迫25
• 1.7.2 miRNA与植物生物胁迫25-26
• 1.8 本研究的目的和意义26-27
• 2 材料和方法27-38
• 2.1 试验材料27-30
• 2.1.1 植物材料与病原菌27
• 2.1.2 主要试剂27
• 2.1.3 引物序列27-29
• 2.1.4 主要仪器29
• 2.1.5 分析软件29
• 2.1.6 分析所用的数据库29-30
• 2.2 试验方法30-38
• 2.2.1 棉苗培养与病菌接种30
• 2.2.2 鉴别不育株和可育株30
• 2.2.3 鉴定不育花粉的败育时期30
• 2.2.4 棉花总RNA的提取和检测30-31
• 2.2.5 miRNA芯片试验31-32
• 2.2.6 预测miRNA的靶基因32
• 2.2.7 数字基因表达谱（DGE）分析32-33
• 2.2.8 小分子RNA文库的构建33
• 2.2.9 小分子RNA的测序33
• 2.2.10 小分子RNA文库的数据分析33-34
• 2.2.11 降解组试验流程34-35
• 2.2.12 降解组测序数据分析35-36
• 2.2.13 qRT-PCR36-38
• 2.2.13.1 miRNA qRT-PCR36-37
• 2.2.13.2 普通基因qRT-PCR37-38
• 3 结果和分析38-70
• 3.1 鉴别不育株和可育株38
• 3.2 不育花粉的败育时期38-39
• 3.3 microRNA芯片实验分析39-46
• 3.3.1 棉花 21A不育株和可育株miRNA差异表达分析39-41
• 3.3.2 qRT-PCR验证分析41-42
• 3.3.3 miRNA的靶基因预测42-46
• 3.4 DGE结果分析46-50
• 3.4.1 DGE初步分析结果46
• 3.4.2 棉花不育株和可育株差异表达基因的筛选46-47
• 3.4.3 参与花粉发育过程的转录因子47
• 3.4.4 差异表达基因参与的主要代谢途径47-49
• 3.4.5 qRT-PCR验证DGE分析结果49-50
• 3.5 黄萎病菌侵染条件下棉花miRNA的差异表达分析50-62
• 3.5.1 小RNA测序的初步分析结果50-52
• 3.5.2 鉴定棉花miRNA52-59
• 3.5.3 黄萎病菌诱导下棉花miRNA的差异表达59-61
• 3.5.4 qRT-PCR验证小RNA测序结果61-62
• 3.6 降解组测序结果分析62-70
• 3.6.1 降解组测序初步分析结果62-63
• 3.6.2 棉花miRNA靶基因鉴定63-70
• 4 讨论70-74
• 4.1 miRNA在花粉发育过程中的作用70-71
• 4.2 棉花 21A不育株和可育株花粉发育早期的差异表达基因71-72
• 4.3 黄萎病菌侵染条件下棉花miRNA的差异表达72
• 4.4 降解组测序技术为检测植物miRNA靶基因提供了新方法72-73
• 4.5 进一步的研究设想73-74
• 5 结论74-76
• 参考文献76-85
• 致谢85-86
• 攻读学位期间发表论文情况86

【共引文献】

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8 田，

本文编号：1125192