大豆疫霉菌阶段发育和毒性变异相关小RNA的鉴定及分析

发布时间：2017-11-02 15:21

  本文关键词：大豆疫霉菌阶段发育和毒性变异相关小RNA的鉴定及分析

  更多相关文章： 大豆疫霉菌 阶段发育 毒性变异 小RNA 表观遗传学

【摘要】：病原菌严重影响植物的生存、生长和生殖等,危害巨大。植物病原卵菌可造成毁灭性的作物生产损失,威胁自然生态系统。卵菌为二倍体真核微生物,其形态和生理上与丝状真菌相似,但在进化上与硅藻和褐藻更近,多数杀真菌剂对卵菌病害的防控无效。卵菌包括疫霉菌、霜霉菌、腐霉菌和白锈菌等。引起爱尔兰大饥荒的致病疫霉菌,每年仍可造成多达67亿美元的经济损失。引起大豆幼苗倒伏或大豆根腐病的大豆疫霉菌,每年造成约10-20亿美元的经济损失。作物病害最有效的防控依赖于抗病性的利用,然而病菌的遗传变异,包括可能的表观遗传变异,频频引起作物抗病性丧失。许多研究者多次观察到疫霉菌的表观遗传现象。小RNA分子,例如si RNA,mi RNA和pi RNA,可通过反义互补配对引起转录水平和转录后水平基因沉默,是真核生物重要的表观遗传调控分子。然而,我们对疫霉菌的小RNA的种类、特征、功能和作用方式等知之甚少。为此,我们以大豆疫霉菌为模式,对其阶段发育和毒性变异相关的小RNA进行分析,主要研究结果如下:1、通过深度测序、计算机识别、传统克隆和Northern杂交等方法,在大豆疫霉菌基因组中发现了大量ts RNA分子(t RNA来源的小RNA分子)。利用自主开发的软件ts RFinder对大豆疫霉菌营养菌丝小RNA的重测序和Northern杂交分析结果表明,t RNA reads富集在29-36 nt,最高峰在33 nt,其5’第一个碱基偏好于碱基G,其次为T。在28-45 nt的小RNA中,t RNA reads高达12.34%,丰度最高的ts RNA-Gly CCC-5p占总reads的2.05%。2、基因组分析和Northern杂交分析表明,ts RNA是一类保守的小RNA分子。Northern杂交分析还表明,其表达模式也相对保守:大多数ts RNA在卵孢子、营养菌丝和孢子囊时期高表达,在侵染和萌发的休止孢时期低表达,而在休止孢时期几乎不表达。通过生物信息分析,我们预测到多个ts RNA候选靶标基因。数字基因表达谱、实时定量反转录PCR等结果表明,大部分候选靶标基因表达模式与ts RNA的表达模式负相关。因此,疫霉菌ts RNA分子可调控靶标基因的表达。3、利用RNA定量和RLM-RACE技术(RNA连接介导的c DNA末端快速扩增技术),确认并捕获到5个靶标基因在大豆疫霉菌菌丝中的降解产物。然而,这些ts RNA靶标基因降解位点不在小RNA的结合位点,与已知的mi RNA介导的靶基因降解机制差异较大。与RLM-RACE结果一致,高通量RNA末端并行测序表明,ts RNA可介导靶基因在邻近结合位点的位置降解,略偏好于其结合位点下游区域。疫霉菌瞬时转化分析表明,疫霉菌ts RNA可序列特异的抑制GUS人工靶标基因的表达。因此,疫霉菌ts RNA分子可与靶标基因反义匹配并引起m RNA降解。4、通过对大豆疫霉菌效应基因Avr1b-1沉默菌株的小RNA深度测序和Northern杂交分析,发现两类与Avr1b-1同源的小RNA分子:即Avr1b-1沉默的触发子Avr1b-1-s RNA和沉默信号Avr1b-1-si RNAs。杂交结果还表明,这两类小RNA都在毒性菌株中累积,而在无毒菌株中不累积。其中,触发子Avr1b-1-s RNA比沉默信号Avr1b-1-si RNAs的累积早12-24小时。进一步的生物信息分析和Northern杂交分析表明,大豆疫霉菌中存在大量与RXLR效应蛋白基因同源的小RNA分子,并且RXLR基因的表达呈负相关。5、基因组分析和反转录PCR数据表明,Avr1b-1位点是双向转录的,其形成的天然反义转录本对为Avr1b-1-s RNA的前体,并通过其产物触发子Avr1b-1-s RNA来调控无毒基因Avr1b-1的表达。反转录PCR数据还表明,Avr1b-1反义链Avr1b-1(-)的差异表达对触发子Avr1b-1-s RNA在毒性菌株和无毒菌株间的差异累积负责。进一步的序列分析表明,Avr1b-1(+)和Avr1b-1(-)的表达水平与其启动子中10 nt左右INDEL(插入和缺失变异)的存在和缺失相关联。
【关键词】：大豆疫霉菌 阶段发育 毒性变异 小RNA 表观遗传学
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S435.651
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 第一章 文献综述13-38
• 1.1 植物病原卵菌13-14
• 1.2 重要的疫霉菌及其危害14-15
• 1.3 疫霉菌的遗传学与生物学15-20
• 1.3.1 疫霉菌的生活史15-17
• 1.3.2 疫霉菌的遗传与变异17-18
• 1.3.3 疫霉菌的遗传操作18
• 1.3.4 疫霉菌无毒基因的克隆18-20
• 1.4 疫霉菌的基因组学和转录组学20-23
• 1.4.1 疫霉菌的基因组学20-22
• 1.4.2 疫霉菌的转录组学22-23
• 1.5 疫霉菌-植物互作23-26
• 1.5.1 疫霉菌的效应蛋白23-24
• 1.5.2 植物免疫系统24-26
• 1.6 小RNA与基因沉默26-35
• 1.6.1 RNAi的发现26-27
• 1.6.2 siRNA的发现、加工和作用方式27-29
• 1.6.3 miRNA的发现、加工和作用方式29-31
• 1.6.4 piRNA的发现、加工和作用方式31-33
• 1.6.5 tRNA来源小RNA的研究进展33-35
• 1.6.6 小RNA在植物病原互作过程中的作用35
• 1.7 疫霉菌小RNA的研究概况35-36
• 1.8 本研究的目的和意义36-38
• 第二章 卵菌编码具有功能的tRNA来源的小RNA分子38-72
• 2.1 背景简介38-39
• 2.2 结果与分析39-63
• 2.2.1 大豆疫霉菌tsRNA的鉴定39-44
• 2.2.2 大豆疫霉菌tsRNA的Northern验证及其保守性分析44-46
• 2.2.3 大豆疫霉菌tsRNA的表达分析46-50
• 2.2.4 大豆疫霉菌tsRNA靶标基因的确定50-53
• 2.2.5 tsRNA的累积与靶标基因的表达呈负相关53-56
• 2.2.6 tsRNA介导靶标基因在结合位点附近的多个位点降解56-62
• 2.2.7 tsRNA结合位点对抑制靶标基因表达至关重要62-63
• 2.3 讨论63-68
• 2.4 材料与方法68-72
• 2.4.1 大豆疫霉菌菌株、培养以及接菌条件68-69
• 2.4.2 RNA提取69
• 2.4.3 深度测序69
• 2.4.4 小RNA克隆69
• 2.4.5 Northern杂交分析69-70
• 2.4.6 RNA定量分析70
• 2.4.7 RLM RACE分析70
• 2.4.8 GUS感知器分析70-71
• 2.4.9 计算分析71-72
• 第三章 tsRFinder的开发及大豆疫霉菌tsRNA的重测序72-92
• 3.1 背景简介72-73
• 3.2 结果与分析73-88
• 3.2.1 tsRFinder的框架及模块73-75
• 3.2.2 tsRFinder的使用75-77
• 3.2.3 tsRFinder的应用例子：拟南芥中的tsRNA77-78
• 3.2.4 大豆疫霉菌小RNA的重测序78-87
• 3.2.5 降解组辅助的大豆疫霉菌tsRNA靶标分析87-88
• 3.3 讨论88-90
• 3.4 材料与方法90-92
• 3.4.1 tsRFinder的开发与调试90
• 3.4.2 大豆疫霉菌重测序数据的获得与分析90-91
• 3.4.3 大豆疫霉菌tsRNA的Northern杂交91
• 3.4.4 降解组辅助的靶基因的分析91-92
• 第四章 大豆疫霉菌中小RNA介导的RXLR基因沉默92-110
• 4.1 背景简介92-93
• 4.2 结果与分析93-104
• 4.2.1 Avr1b-1-sRNA的发现93-94
• 4.2.2 Avr1b-1-sRNA引发的基因沉默信号只在毒性菌株中累积94-96
• 4.2.3 小RNA与大量RXLR效应蛋白基因表达相关96-98
• 4.2.4 双向转录介导的Avr1b-1-sRNA的产生98-100
• 4.2.5 启动子的短序列变异与Avr1b-1和Avr1b-1-sRNA的转录相关联100-102
• 4.2.6 启动子区域短序列插入/缺失变异广泛存在且受自然选择102-104
• 4.3 讨论104-108
• 4.4 材料与方法108-110
• 4.4.1 生物信息学分析108
• 4.4.2 大豆疫霉菌菌株及其培养108
• 4.4.3 大豆幼苗的接菌108-109
• 4.4.4 疫霉菌及植物RNA的提取109
• 4.4.5 Northern杂交试验109
• 4.4.6 RT-PCR分析109-110
• 第五章 结论110-113
• 5.1 结论110-111
• 5.2 创新点111-112
• 5.3 展望112-113
• 参考文献113-145
• 附录145-148
• 致谢148-149
• 作者简介149-150

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 王子迎;王源超;张正光;郑小波;;土壤中大豆疫霉菌诱捕方法的改进[J];植物病理学报;2005年06期

2 王良华;丁国云;王源超;郑小波;;大豆疫霉菌检测技术研究进展[J];植物检疫;2006年06期

3 徐静静;王晓鸣;武小菲;朱振东;;基于细胞色素氧化酶基因和激发素基因的大豆疫霉菌特异性PCR引物[J];植物保护;2008年05期

4 刘春来;李新民;杨明秀;;大豆疫霉菌检测鉴定方法[J];大豆科学;2008年03期

5 李丽s，

本文编号：1132095