番茄早疫病菌对啶酰菌胺的抗性检测及抗性机理初探

发布时间：2017-11-05 17:16

  本文关键词：番茄早疫病菌对啶酰菌胺的抗性检测及抗性机理初探

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【摘要】：由Alternaria solani侵染所引起的番茄早疫病是栽培番茄上的一种叶部病害,影响着番茄的产量和质量。啶酰菌胺于2008被引入中国用于番茄早疫病的防治。然而,在使用5年后仍然没有A. solani对啶酰菌胺的敏感性／抗性方面的相关报道。因此,本文检测了山西省不同地区番茄早疫病菌A. solani对啶酰菌胺的敏感性,明确了山西省各地区A. solani对啶酰菌胺抗性的现状,并对抗性菌株的适合度、生物学特性、细胞膜渗透性、生理生化特性及抗药性分子机理等方面进行了研究,主要研究结果如下：1、从山西省五个地区共采集分离到100株A. solani,通过测定菌株对啶酰菌胺的敏感性发现：啶酰菌胺对这些菌株EC50值范围为0.3104～164.1976μg·mL-1,均值为12.9354±25.007μg·mL-1,这些田间菌株对啶酰菌胺的敏感性有较大差异,有54%的菌株对啶酰菌胺产生了抗性,其中抗性(R类)菌株中有76%中抗(RM)菌株；这些R类菌株在忻州和运城地区出现频率最高,且还在忻州地区检测到了2株极高抗(RVH)菌株。各地区A. solani对啶酰菌胺的抗性指数(RI)范围为0.28～0.49,均值为0.38士0.08,经卡平方独立性检测发现这五个地区的A. solani对啶酰菌胺的抗性无显著差异(χ2=0.78χ2 0.05,20,P0.05)。2、测定了A. solani抗、感啶酰菌胺菌株的适合度,并采用常用杀菌剂对R类菌株进行防治。结果表明：各抗性水平菌株在无啶酰菌胺的平板上连续培养20代后,抗性不丧失,可稳定遗传。R类菌株的菌丝生长明显随着抗性的增高而有所下降(P0.05)；产孢量比敏感(S类)菌株的明显增多(P0.05),但孢子萌发率无明显变化(P0.05)；产毒量增多(P0.05),导致抗性菌株致病力的增强；由此可推断R类菌株在自然环境中存活的概率较大,利于形成有优势的抗性群体。A. solani对啶酰菌胺和对其他4种常用杀菌剂(啶菌VA唑、苯醚甲环唑、多抗霉素和杀毒矾)之间不存在交互抗性。多抗霉素对各个抗性水平菌株的防治效果,包括占优势的RM菌株,都没有显著差异(P0.05),故可将多抗霉素看作是防治啶酰菌胺抗性群体的最好选择。3、比较了A. solani抗、感菌株的菌丝形态,测定了它们的最适温度和pH值,研究了不同营养条件对A. solani抗、感菌株生长的影响。结果表明：R类菌株菌丝的横隔增多,且颜色加深,RM类和RVH类菌株菌丝直径变小。25℃时,R类菌株的生长速率明显低于S类菌株的(P0.05),30℃时,R类与S类菌株的生长速率则无明显差异(P0.05)。s类和RM类菌株的最适生长温度为25℃,高抗(RH类)和RvH类菌株的最适生长温度为25-30℃。S类、RM类、RH类和RVH类菌株的最适pH值分别为6～8、5～9、5～8、5～8(P0.05),最佳碳源分别为淀粉和乳糖、淀粉和乳糖、乳糖、淀粉,最佳氮源分别为蛋白胨、蛋白胨、大豆粉、玉米粉和蛋白胨。说明A. solani对啶酰菌胺产生抗性后,菌丝形态发生了一定的变化,最适生长温度有所提高,最适pH值的范围有所改变,对营养的要求也有了一定程度的改变。4、比较了A. solani抗、感菌株对渗透压的敏感性,观察了药剂胁迫下其电导率及细胞内相关物质的变化。结果发现：菌株对啶酰菌胺的抗药性与对NaCl渗透压的敏感性之间的极显著相关(P0.01)。RM类和RVH类菌株适应啶酰菌胺的能力明显高于S类菌株,膜受损伤的程度相对较小,RH类菌株则明显弱于S类菌株,膜受损伤的程度相对较大,可推断RH类菌株有可能以加快药剂在体内的排泄来维持生长,而RM类及RVH类菌株则通过降低细胞膜透性以阻止药剂浸入体内来维持生长,并且在从中抗向高抗性发展的过程中,菌株的细胞膜或者胞内物质似乎发生了一些改变来应对啶酰菌胺。R类菌株细胞内可溶性糖含量明显降低(P0.05),可溶性蛋白的含量明显增加(P0.05),但没随着抗性的增加而呈现上升或下降的趋势,R类菌株的可溶性蛋白种类比s类菌株的多出可能与抗药性有关的Rf=0.06和Rf=0.45的特异性谱带,且R类菌株中若干个可溶性蛋白的表达量增多；随着A. solani对啶酰菌胺抗性的增加,细胞膜中甘油的含量逐渐降低。5、研究了A. solani抗、感菌株内保护性酶类和SDH酶的活性,比较酯酶同工酶图谱来明确抗、感菌株是否存在稳定的特异性差异。研究表明：与S类菌株的相比,R类菌株的CAT、SOD和SDH活性明显升高(P0.05)；在啶酰菌胺胁迫下,S类菌株的CAT和SOD活性明显升高,但其活性随着药剂浓度的增加而明显下降(P0.05),R类菌株的CAT和SOD活性则呈下降趋势,但R类菌株的SOD活性始终高于S类菌株的,各供试菌株的SDH活性随着药剂浓度的增加而显著受到抑制(P0.05)；且抗性水平越高的菌株,啶酰菌胺对其SDH活性的抑制效果越差。Rf=0.60和Rf=0.74的特异性酯酶同工酶谱带为RH类和RVH类菌株所缺失,其所对应的酶可能在菌株形成高水平抗性后表达上出现了差异。6、为了分析A. solani抗啶酰菌胺的分子机理,克隆了抗、感菌株的Sdh基因,翻译成蛋白序列并进行比对。SDH复合体亚基的突变会导致细胞产生过量的ROS,因此还测定了抗、感菌株ROS含量的变化,及在药剂胁迫下的变化。本研究检测出了RM菌株的SdhB亚基上除了已报道H278R突变外,还存在163T和K261M,RH菌株的SdhB亚基出现V245G和E263D突变,RVH菌株的SdhB亚基上出现S61L突变；未发现R类菌株的SdhC亚基存在突变；RH和RvH菌株SdhD也未发生突变,而RM菌株的SdhD亚基上出现T47A突变。该现象的出现可能与本文菌株采集地与文献中采集地的用药策略不同有关,也可能是菌株对其他杀菌剂产生抗性而导致Sdh蛋白发生突变,还可能与菌株来源地的差异有关。R类菌株中ROS量比S类菌株的明显增多；在啶酰菌胺系列浓度胁迫时,在相同的条件下,R类菌株ROS量始终明显高于S类菌株的ROS量,但都呈下降趋势,有可能是药剂在抑制SDH复合体时也影响到了新陈代谢,同样也影响了ROS的产生。另外,在SdhB、SdhC和SdhD上都发现了无义突变,至于这些无义突变是否会影响到ROS的产生有待于进一步研究。
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S436.412.14

【参考文献】

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本文编号：1145135