双壳类C型凝集素免疫功能及分子识别机制的研究

发布时间：2017-11-10 06:06

  本文关键词：双壳类C型凝集素免疫功能及分子识别机制的研究

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【摘要】：C型凝集素是一类含有钙离子(Ca2+)依赖糖识别域(Carbonhydraterecognition domain,CRD)的蛋白超家族,是固有免疫系统中的重要模式识别受体(Pattern-recognition receptor,PRR)。本论文综合利用分子生物学、免疫学、生物信息学等技术,以双壳类栉孔扇贝Chlamys farreri、海湾扇贝Argopecten irradians和长牡蛎Crassostrea gigas为材料,开展了含多个CRD的C型凝集素(CfLec-4)、含单个CRD的C型凝集素(AiCTL-2、AiCTL-3、AiCTL-4、AiCTL-7)和锚定在膜上的C型凝集素(CgCLec-5)的克隆与表达研究,结合结构特征探讨了其糖识别机制,阐释了双壳类C型凝集素在免疫防御中的作用。栉孔扇贝C型凝集素CfLec-4含四个CRD结构域,其Ca2+结合位点2关键氨基酸基序分别含EPD/LSD、EPN/FAD、EPN/LND和EPN/YND。该蛋白在栉孔扇贝的肝胰腺、肾和性腺中特异性分布。当栉孔扇贝受到脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、肽聚糖(Peptidoglycan,PGN)和β-葡聚糖(β-glucan)刺激后,血淋巴细胞中Cf Lec-4的mRNA表达水平显著上升。Cf Lec-4的重组蛋白(rCfLec-4)能在体外结合LPS、PGN、Glucan和甘露聚糖(Mannan),而对脂磷壁酸(Lipoteichoic acid,LTA)无结合活性。rCfLec-4能结合藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鳗弧菌(Vibrio auguillarum)、大肠杆菌(Escherichia coli)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。Cf Lec-4具有调理作用能显著促进栉孔扇贝血淋巴细胞对病原菌的吞噬。CfLec-4的四个CRD结构域(rCRD1,rCRD2,rCRD3和rCRD4)具有不同的PAMPs结合谱及结合活性。rCRD3和rCRD4均能结合LPS、PGN、Glucan和Mannan,而rCRD1和rCRD2仅结合LPS和Mannan。rCRD3对glucan、LPS和Mannan的结合活性较强,而rCRD4对PGN表现出较强的结合活性。四个CRD的菌结合谱也有较大差异,其中rCRD3具有与rCf Lec-4一致广谱的菌结合活性。另外,rCRD1、rCRD3和rCRD4能显著促进栉孔扇贝血淋巴细胞对大肠杆菌的吞噬,而rCRD2未检测到促吞噬活性。结果表明,Cf Lec-4作为模式识别受体具有广谱的免疫识别活性,其四个CRD具有不同的PAMPs与外源微生物识别谱及识别活性和促吞噬活性,出现了免疫功能的分化。本论文对海湾扇贝中Ca2+结合位点2含EPD/WSD的C型凝集素Ai CTL-7进行了免疫活性研究。发现raictl-7能结合lps、pgn、mannan、glucan和聚肌苷酸胞苷酸(polyi:c),具有广谱的pamps结合活性,并能特异性结合甘露糖(d-mannose)和半乳糖(d-galactose)两种单糖。raictl-7能结合耶罗维亚酵母、毕赤酵母、金黄色葡萄球菌、鳗弧菌和大肠杆菌,并能凝集包括金黄色葡萄球菌、鳗弧菌、耶罗维亚酵母和毕赤酵母在内的多种微生物。raictl-7能在较低的蛋白浓度(0.59μgml-1)下凝集兔血细胞。raictl-7与大肠杆菌孵育后能显著抑制大肠杆菌的生长。结果表明作为模式识别受体,含单个crd的c型凝集素aictl-7具有广谱的pamps和微生物识别活性及凝菌和抑菌活性。本论文对海湾扇贝中ca2+结合位点2含epn基序的三个c型凝集素(aictl-2,aictl-3和aictl-4)的免疫活性进行了比较研究。发现三个c型凝集素的组织分布规律相似,在扇贝的肌肉、血细胞、外套膜、鳃、性腺和肝胰腺等组织呈组成型表达,并以肝胰腺中的表达水平最高。三个c型凝集素具有相似的pamps结合谱,其中raictl-3和raictl-4能结合lps、pgn和glucan,raictl-2能结合lps和pgn,但三个c型凝集素均不能结合mannan。进一步研究发现它们对同一种pamp的结合强度存在差异,其中raictl-2对lps和pgn的结合活性较强,而raictl-4对glucan具有较强的结合活性。raictl-2与raictl-4仅结合金黄色葡萄球菌,而raictl-3能结合金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及鳗弧菌,具有相对广谱的菌结合活性。raictl-4在较低蛋白浓度(6.25μgml-1)下仍具有较强的凝集兔血细胞的活性,而raictl-2和raictl-3的凝集活性较弱。另外,raictl-2,raictl-3和raictl-4都能显著促进海湾扇贝血淋巴细胞对大肠杆菌的吞噬活性。结果表明aictl-2,aictl-3和aictl-4作为模式识别受体能结合pamps及微生物。但由于关键结合位点的差异,三个c型凝集素具有不同的pamps结合活性和菌结合谱,其凝集活性也有较大差异。本论文对长牡蛎中锚定在膜上的c型凝集素cgclec-5胞外段crd结构域进行了基因克隆和蛋白重组表达。发现cgclec-5蛋白主要分布于血淋巴细胞表面、鳃、神经节和外套膜中。胞外段crd结构域能结合lps、pgn和mannan。cgclec-5能显著促进长牡蛎血淋巴细胞对灿烂弧菌(vibrosplendidus)的吞噬。本论文研究的c型凝集素能作为模式识别蛋白识别并结合pamps及微生物,能凝集微生物并抑制微生物的生长,还能作为调理素促进血淋巴细胞对微生物的吞噬作用,在双壳类动物免疫防御过程中发挥重要作用。研究成果为深入了解双壳类免疫识别分子的结构与功能,阐明软体动物的免疫防御机制奠定了基础。
【学位授予单位】：中国科学院研究生院(海洋研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

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1 杨嘉龙;栉孔扇贝关键模式识别受体介导的免疫应答机制研究[D];中国科学院研究生院（海洋研究所）;2011年

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本文编号：1165371