桔小实蝇piRNA通路相关基因tudor及海藻糖酶基因对卵巢发育影响的研究

发布时间：2017-11-26 12:20

  本文关键词：桔小实蝇piRNA通路相关基因tudor及海藻糖酶基因对卵巢发育影响的研究

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【摘要】：桔小实蝇Bactrocera dorsalis (Hend el)是一种重要的果蔬害虫,寄主与分布范围广,现已逐渐成为最为重要的柑橘害虫之一。桔小实蝇繁殖能力强,成虫产卵于果实内,幼虫孵化后寄居果实内取食,造成果实腐烂及落果。目前控制桔小实蝇的主要手段为性诱剂和化学杀虫剂的联合应用,但多地均报道该虫对多种杀虫剂产生了抗药性,因此亟需开发新型高效杀虫剂以对桔小实蝇进行持续防控。卵巢是昆虫雌性生殖系统的重要组织,直接关系着昆虫后代的繁衍。卵巢的发育调控与昆虫的种群控制密切相关,相关领域的研究一直是昆虫发育学研究的热点,也是探索害虫控制新方法的重要途径。本学位论文以桔小实蝇为研究对象,在对桔小实蝇卵巢转录组测序的基础上,筛选和鉴定与卵巢发育相关的基因,解析这些基因的分子特性和功能,以期为以卵巢发育相关基因为靶标的新型杀虫剂的开发奠定理论基础,主要研究结果如下：1.桔小实蝇卵巢转录组测序及卵巢发育相关基因定量分析转录组可以快速准确的获取生物体内的转录本信息。采用Illumina Hiseq平台对桔小实蝇羽化后不同日龄的成虫卵巢进行转录组测序。分析测序结果发现,共获得contig 44,845条,所获contig进一步拼接为23,822个unigene, unigene平均长度为1,116 bp,说明该转录组质量较高。以E=10-5为阈值,分别有15,473、12,603、11,068、6,102和11,043个unigene匕对注释到相关数据库(Nr、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO)。对在Nr数据库进行比对的unigene进行物种同源性分布分析,结果表明,这些unigene的同源分布主要集中于果蝇属昆虫(79.5%),其中,13.68%的unigene与果蝇Drosophila virilis相关基因的同源性最高,其次为黑腹果蝇Drosophila melanogaster (11.87%)。对桔小实蝇卵巢中组装出的unigene进行GO分类发现,在59个功能组中,注释unigene最多的3个功能组依次为“细胞过程”、“单有机体过程”和“细胞部分”,分别含有8,227(74.5%)、7,228(65.5%)和6,655(60.3%)个unigeneo注释unigene最少的功能组为“蛋白标记”和“受体调节活性”,均只包含1个unigene。对桔小实蝇卵巢中组装出的unigene进行COG分类发现,在25个功能组中,注释unigene最多的功能组是“一般功能预测”,包含有2,653个unigene,注释最少的功能家族为“核结构”,仅包含2个unigene。GO和COG分类结果初步反映了桔小实蝇卵巢转录组中基因的功能分布情况。在完成桔小实蝇卵巢转录组分析后,对与卵巢发育相关的通路基因进行鉴定,共筛选出属于11条通路的30个基因,包括37个unigene或contig。其中,属于骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein, BMP)信号通路的基因有2个、属于钙粘蛋白(E-cadherin)通路的基因有2个、属于Notch通路的基因有2个、属于piRNA通路的基因有4个、属于胰岛素信号通路的基因有4个、属于信号传导及转录激活因子(JAK-STAT)通路的基因有2个、属于蜕皮激素(Ecdysone)信号通路的基因有5个、属于脂质消化与吸收(Fat digestion and absorption)通路的基因有4个、参与卵黄原和极细胞形成过程的基因各2个以及海藻糖代谢中的海藻糖酶基因1个。进一步对其中的30个通路基因采用定量PCR技术分析其在桔小实蝇头部、胸部、中肠、马氏管、卵巢和脂肪体中的表达量,结果表明：BMP信号通路基因主要在中肠中表达,钙粘蛋白和JAK-STAT信号通路基因主要在马氏管中表达,Notch、piRNA通路和极细胞形成相关基因主要在卵巢中表达,胰岛素信号通路和蜕皮激素信号通路在各检测的组织中均有较为一致的表达水平,脂质代谢通路和卵黄原蛋白基因主要在脂肪体表达,海藻糖酶基因在头部、中肠和卵巢中高表达。不同通路基因在各组织器官的特异性表达暗示出这些基因潜在的生理功能,这对后续的基因功能验证研究具有指示意义。2.桔小实蝇piRNA通路相关基因的克隆与序列分析由于piRNA通路相关基因piwi、argonaute3、aubergine和tudor在桔小实蝇卵巢高表达以及该通路涉及小分子RNA的特异性,本研究选择该通路基因进行深入分析。基于桔小实蝇卵巢转录组数据库中的unigene信息,克隆获得了相关基因Bdpiwi (KR013230)、Bdago3 (KR013228)、Bdaub (KR013229)和 Bdtud (KR013231)的cDNA全长序列。对这些基因编码蛋白的理化性质和序列功能区域进行预测分析,发现这4个蛋白质均不属于膜蛋白,并且Bdpiwi、Bdago3和Bdaub具有非常相似的结构,只包含1个PAZ功能域和1个PIWI功能域,在2个功能域中共包含7个和4个活性位点,并且在PIWI功能域中均含有5’末端RNA链锚定点,预示这些基因与piRNA形成过程中RNA链的剪切存在密切联系；对Bdtud基因的分析表明,该基因编码的氨基酸序列含有10个Tudor功能域,并且在第2-10个功能域内包含有4个二甲基化精氨酸结合位点,这也预示着Bdtud具有与PIWI家族蛋白进行结合的能力。通过对昆虫的Piwi、Ago3和Aub进行系统发育分析,发现Piwi与Aub聚为簇,这两个蛋白可能具有更高的同源性,而Ago3单独为一簇,其分化程度较Piwi和Aub更大；对昆虫中tudor序列以及与其同源的3个Tudor功能域蛋白序列Spindle-E、Tudor-SN口Partner of P WI进行比对,结果表明,Tudor功能域蛋白中,tudor与 Partner of PIWI亲缘关系较近,来源于同一点,其次为Tudor-SN,亲缘关系最远的为Spindle-E,说明昆虫Tudor可能与Partner of PIWI具有相似的功能。通过对piRNA通路相关基因进行序列和系统进化分析,初步探究了这些基因可能存在的功能,为后续的功能鉴定奠定了基础。3.基于RNAi技术的桔小实蝇piRNA通路相关基因的功能分析为深入探究桔小实蝇Bdtud基因在卵巢中的功能,采用RNAi技术抑制Bdtud基因的表达量,检测相关基因表达量并观察表型变化情况。结果表明,注射Bdtud基因的dsRNA后,在桔小实蝇整虫中引起Bdtud的沉默效率与对照比较并不明显,但在卵巢中产生了明显的沉默效果。同时在整虫和卵巢中亦引起Bdpiwi、Bdago3和Bdaub表达量的下降。观察注射dsRNA后成虫卵巢的发育状况,结果发现注射dsRNA后直径小于0.6 mm的卵巢数显著多于对照,而直径大于或等于1.0mm的卵巢数显著少于对照,说明Bdtud在卵巢中表达量的下降引起卵巢发育滞后；注射dsRNA的雌成虫与正常雄虫进行配对,发现交配率显著低于对照,且产卵量下降,表明由于卵巢发育滞后影响了交配率和产卵量；进一步研究发现注射dsRNA后,极细胞形成相关基因Nanos的表达量显著下调,说明抑制Bdtud的表达可能影响极细胞的正常形成。基于以上结果提出了Bdtud调控卵巢发育的理论模型：即Bdtud可能通过影响piRNA通路及极细胞形成共同维持卵巢的正常发育。上述研究结果揭示出Bdtud可能是一个潜在的调控桔小实蝇或其他害虫生殖发育的作用靶标。4.桔小实蝇tudor基因干扰后差异基因表达谱分析为进一步阐明Bdtud介导卵巢发育的分子机理,采用数字基因表达谱技术对dsTUDO R处理后的卵巢进行差异表达基因分析。结果显示,对桔小实蝇进行dsRNA处理后与对照相比分别有188和558个基因发生表达量的上调和下调。对差异基因进一步筛选与比对后,发现差异倍数(Log2RPKM)超过5倍的上调和下调基因数分别为4个和6个。另外有3个下调基因被注释为表皮发育调控因子受体,暗示其在维持卵母细胞的分化中具有作用,并且在上调、下调基因中各存在1条unigene分别被注释为GST和P450家族基因,其具体调控机理尚待研究。上述研究结果说明干扰Bdtud基因表达使卵巢内的众多通路和基因产生了复杂的级联反应,导致卵巢发育滞后。这为进一步明晰Bdtud介导的卵巢发育分子机理奠定了基础。5.桔小实蝇海藻糖酶基因的克隆及功能初探为研究海藻糖酶在卵巢发育中是否具有决定性的调控作用,基于转录组中的unigene信息,采用RACE结合PCR技术克隆得到桔小实蝇膜结合型海藻糖酶基因BdTre2的cDNA全长序列,序列分析发现该基因具有1个跨膜结构域,并且存在2个海藻糖酶标签序列,证明其属于膜结合型的海藻糖酶。对昆虫可溶性海藻糖酶及膜结合型海藻糖酶基因进行系统发育分析,结果显示两种类型的海藻糖酶分别聚为一簇。进一步采用RNAi技术分析桔小实蝇BdTre2的功能,发现注射dsRNA后BdTre2的沉默效率达到80%,说明该基因能被有效沉默。RNAi处理后桔小实蝇体内海藻糖含量增多,但处理后卵巢直径未发生显著变化,预示海藻糖酶基因对桔小实蝇卵巢的供能具有一定的作用,但并非卵巢发育过程中的关键基因。综上所述,通过桔小实蝇卵巢转录组测序,获得了大量在卵巢表达的基因信息；采用定量PCR技术对筛选出的11条通路中的30个基因在桔小实蝇不同组织中的表达模式进行了解析；克隆获得了piRNA相关通路基因及海藻糖酶基因,应用RN Ai技术对这些基因的功能进行了分析,发现干扰piRNA通路相关基因tudor的表达后引致卵巢发育滞后,继而影响交配率和产卵量,其原因可能与piRNA的生成受阻有关；同时,干扰tudor基因的表达也影响极细胞的正常发育,进而对原始生殖细胞及生殖干细胞的正常形成产生影响,并导致卵巢发育异常。桔小实蝇海藻糖酶基因可能影响卵巢供能,但并非关键因素。研究结果为进一步探索与桔小实蝇卵巢发育的相关基因的功能以及基于雌性生殖调控为靶标的有效控制提供了科学依据。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S433

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本文编号：1229775