水稻黄绿叶突变体ys83和脆性突变体b364的基因克隆

发布时间：2017-12-07 05:16

  本文关键词：水稻黄绿叶突变体ys83和脆性突变体b364的基因克隆

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【摘要】：利用正向或反向遗传学的方法,对水稻(Oryza sativa L.)多种多样突变体的遗传分析和分子机理研究,揭示了高等植物中许多重要的功能基因和生物学进程,具有十分重要的理论和应用价值。水稻叶色突变体和脆性突变体便是其中常见的研究对象,叶色突变体和突变基因的发掘为植物光合色素的合成或降解、叶绿体的发育以及质核信号通路等细胞进程的研究奠定了大量的理论基础：同样,脆性突变体和相关基因的探索也为植物细胞壁的合成、纤维素的合成与降解甚至生物能源的开发拓展了思路。我们实验室通过化学诱变等途径获得一个黄绿叶突变体ys83和一个脆性突变体b364,本研究从表型鉴定、基因克隆、功能分析等方面,对这两个突变体进行了较为系统、深入的研究和探讨,主要结果如下：1.水稻黄绿叶突变体yS83的基因克隆和功能分析黄绿叶突变体ys83在苗期表现为黄绿叶,随着植株生长颜色逐渐加深,但直到成熟期仍然呈现与野生型可分辨的浅绿色。通过比较成熟期的主要农艺性状,发现ys83突变体的单株有效穗数和每穗着粒数较野生型日本晴分别下降6.7%和7.6%,其余农艺性状包括抽穗期、株高、结实率和千粒重等没有明显变化。光合色素测定结果显示,突变体苗期和抽穗期的叶绿素和类胡萝卜素含量都严重减少,尤其是苗期的色素含量几乎只占野生型的50%左右,说明yS83的黄绿叶表型是由叶绿素的减少引起的。观察ys83突变体的叶绿体超微结构时发现,与野生型相比,突变体内叶绿体的发育受到了严重阻碍,叶绿体狭小细长,基粒垛叠松散且数目少。运用图位克隆的方法,ys83突变基因被定位在水稻第2条染色体短臂上约158kb的范围内,经检索水稻基因组注释工程数据库,在该定位区间内共有23个注释基因。经PCR扩增并测序验证比对,确定LOC_Os02g05890基因即为ys83突变体的候选基因,在ys83突变体中,该基因编码区的第198位碱基T突变为A,使其第66个密码子由TGT变为TGA,翻译提前终止,该基因被命名为YS83。进一步用转基因互补实验来验证这一结果,来自野生型的YS83基因被连接到表达载体pCAMBLA2300上,将质粒pC2300-YS83通过农杆菌介导法转入到ys83突变体中。经PCR检测的转基因阳性植株,都恢复了野生型的表型,色素含量与野生型一致,证明YS83基因确实是控制ys83突变性状的目的基因。YS83基因(LOC_Os02g05890)的编码区序列全长为498bp,在水稻基因组中以单拷贝形式存在,推测可能编码一个分子量17kDa的含165个氨基酸的EMB1303蛋白。经蛋白质结构分析软件预测,在YS83蛋白的N-端可能含有一个51氨基酸组成的叶绿体定位信号肽,靠近C-端含有一个甘氨酸富集结构域。进一步用亚细胞定位实验验证了YS83蛋白确实定位在叶绿体上。YS83蛋白序列与其同源蛋白序列比对及进化树结果显示,YS83蛋白与来自单子叶植物的同源蛋白比双子叶植物的同源蛋白具有更高的相似性和更近的亲缘关系。YS83基因在水稻植株各组织中均有表达,然而在生长发育旺盛的组织中转录水平更高。与野生型相比,与叶绿体发育和叶绿素生物合成相关的多个基因在ys83突变体内的表达均受到了不同程度的影响,说明YS83基因很可能是通过调节水稻叶绿体发育和叶绿素合成相关基因的表达进而在叶绿体的发育中发挥重要作用的。2.水稻脆性突变体b364的遗传分析与基因克隆脆性突变体b364植株的叶片、叶鞘、茎杆、穗子等部位都表现出脆的特性,除此以外,其它外观表型和产量性状与野生型并无明显差异。在环境扫描电镜下观察突变体和野生型的叶片与茎秆横切面时发现,野生型的厚壁组织结构致密,而突变细胞排列松散,呈现中空的网状结构。接下来,在透射电镜下观察细胞壁结构时发现,突变体的叶脉细胞的细胞壁厚度与野生型有明显差异,并且次生壁的厚度变化最大。这说明b364突变体的细胞壁合成受到了影响,尤其是提供主要机械支撑力的厚壁组织结构改变,细胞次生壁变薄,因此导致了其机械强度降低的表型。将b364与野生型亲本日本晴和籼稻品种明恢63、冈46B杂交后,得到的F1植株也表现出脆性的表型,这说明该脆性性状呈显性遗传,F2代群体分离符合3：1比例,表明该脆性表型受一对显性核基因控制。接下来利用图位克隆技术,将b364突变基因定位在了水稻第1条染色体长臂约145kb的范围内。这一区间共有注释基因23个,其中8个是转座子,余下的15个基因中,根据其预测的蛋白功能,优先选择其中4个作为候选基因进行PCR扩增和测序验证,结果发现b364突变体中一个基因发生了一对碱基突变,导致相应氨基酸发生改变,此基因即被认为是b364脆性性状的候选基因并被命名为B364。因正在进行后续实验,基因具体编号需要暂时保密,请理解。随后将该显性突变基因通过转基因技术导入野生型亲本日本晴中,得到的阳性转基因株系表现出脆性性状,从而验证了该候选基因。这些结果说明,脆性突变体b364的脆性表型确实是由于B364基因的突变引起的。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S511

【参考文献】

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本文编号：1261276