小麦抗条锈病基因Yr41的精细定位和两个条锈菌诱导表达基因的功能研究

发布时间：2017-12-07 20:21

  本文关键词：小麦抗条锈病基因Yr41的精细定位和两个条锈菌诱导表达基因的功能研究

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【摘要】：小麦条锈病是由条锈菌(Puccinia striiformis West.f.sp.tritici)引起的叶部真菌病害,是世界性的小麦病害,在中国尤为严重,严重危害小麦产量与品质。培育抗病小麦品种是防治条锈病的有效方法,但随着条锈菌新生理小种的不断出现,特别是V26新小种的出现,致使大部分抗病小麦品种丧失抗性。通过对抗病基因紧密连锁的分子标记开发和精细定位,为抗病基因的克隆、分子标记辅助育种和多基因聚合的持久抗性品种培育奠定基础,对小麦抗条锈病遗传育种研究具有理论和实践价值。小麦抗病防御反应是多基因参与的调控过程,通过对抗条锈病调控基因的克隆与表达特性分析,探讨这些基因在抗条锈病防御反应中的作用机理,为阐明寄主与条锈菌间互作的分子机理提供科学依据。本研究以抗条锈病基因Yr41载带的小麦抗病品种川农19(CN19)为研究材料,通过构建的CN19/MY11遗传连锁作图群体及其高代重组自交系,进行了条锈菌CRY32接种下的作图群体单株抗病性鉴定和遗传分析；采用比较基因组分析和BSA-RNA-Seq测序方法,进行了EST-STS和SNP引物的开发和标记筛选,绘制Yr41基因的精细连锁遗传图；利用实时荧光定量PCR(Q-RT-PCR)与病毒诱导基因沉默(VIGS)的技术,对已克隆的条锈菌诱导表达基因TaLHY和TaNIT,进行了基因表达特性与功能研究,主要研究结果如下：1.配制了小麦品种CN19/MY11杂交F_1、F_2、F_(2：3)代研究群体,进行了抗条锈病遗传分析,进一步明确了小麦品种CN19中含有的Yr41基因是一个显性的成株期抗条锈病基因；构建了含3212个单株的CN19/MY11杂交F_2代遗传作图群体及其高代重组自交系,通过小麦2BS上公布的EST序列,设计了127个EST-STS分子标记引物,利用F_(2：3)分离群体分组法(BSA)对该EST-STS引物进行筛选,共获得了8对与Yr41基因基因紧密连锁的分子标记,通过Kosambi函数计算与目的基因的连锁关系：BE444541-BE474133-BE604911-Yr41-BE446068-BE444659-BF478477-BI479116-BE496167,分子标记间相对遗传距离分别为0.83、0.19、0.06、0.19、0.06、0.44、0.19与0.32cM,使Yr41基因两边连锁标记距离由8.9cM缩短至0.25cM,最小标记达到0.06 cM,将Yr41基因进一步定位在小麦2BS3-0.84-1.00区段内。2.通过Blast本地化程序将紧密连锁的8条EST序列与小麦基因组草图以及短柄草、水稻和玉米基因组进行同源关系分析,根据同源基因位点,共设计201个分子标记,但筛选结果显示这些分子标记与Yr41没有连锁关系。通过生物信息学方法对这8条EST序列对应的基因注释结果显示,近共分离的EST序列BE604911注释信息为THO复合体,该蛋白在拟南芥中证实为植物抗病防御的关键蛋白,可作为Yr41的候选基因进一步研究。3.通过对重组自交系(RIL)F_6代中抗病和感病两个表现型50(纯抗)+50(纯感)样本组进行BSA-RNA-Seq转录组高通量测序,共得到57.14Gb Clean Data。利用生物信息方法对这些数据进行分析,共计注释约1.5万个小麦新基因,在抗病和感病两个表现型样本组中筛选到5919个差异表达基因。对BSA群体进行SNP位点的关联定位分析,在2BS染色体上寻找到52个SNP位点,其中有38个SNP位点设计出四引物扩增受阻突变体系引物。通过对作图群体单株DNA的PCR产物检测,共计发现4个SNP位点与Yr41紧密连锁,他们与目的基因的连锁关系为3523042/2963-3523042/3033-5186704/3797-Yr41-5245446/8902,其中3523042/2963、3523042/3033与5186704/3797分子标记与目的基因的遗传距离为0.06 cM,5245446/8902分子标记的遗传距离为0.25cM,增加了Yr41所在区段的密度。4.对TaLHY基因的表达和功能研究结果初步证明了该基因调控和参与小麦的穗生长与抗条锈病的防御反应过程；发现TaLHY是小麦昼夜节律基因,具有白天上调表达,夜晚下调表达量特性。利用实时荧光定量PCR的结果显示,TaLHY基因主要在小麦叶、穗与茎组织中表达,根部表达较少；外源激素SA能极显著的诱导该基因上调表达。在拔节期对抗病小麦CN19进行VIGS基因沉默,发现TaLHY沉默植株无法抽穗,对条锈菌生理小种条中32亲和互作表现感病(IT=4)。5.利用VIGS方法对克隆的TaNIT(晴水解酶)进行基因沉默研究,发现抗病植株沉默和未沉默植株的生长和对条锈菌应答反应无明显变化。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S435.121.42

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本文编号：1263666