畜禽粪便厌氧发酵过程中抗生素抗性基因变化机理研究

发布时间：2017-12-08 05:19

  本文关键词：畜禽粪便厌氧发酵过程中抗生素抗性基因变化机理研究

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【摘要】：抗生素抗性基因(ARGs)作为一种新型环境污染物,其危害在于可以通过水平基因转移使致病菌获得抗性,从而导致抗生素失效,严重威胁人类健康。抗生素和重金属作为饲料添加剂被大量用于规模化养殖业,导致畜禽粪便成为抗生素、重金属和ARGs的重要储存库。厌氧发酵是畜禽粪便资源化利用的处理途径之一,发酵产物沼液沼渣的农用是ARGs进入环境的重要途径。本文用实验室模拟的方法研究了畜禽粪便残留的抗生素和重金属、发酵参数(温度、含固量)以及添加剂对厌氧发酵过程和产物中ARGs的影响,分析了ARGs、移动基因元件(MGEs)和微生物群落的关系,以期揭示不同因素影响ARGs变化的微生物学机理。取得的主要结果和结论如下:(1)高温厌氧发酵使牛粪中8/10的ARGs丰度显著降低,其中5/10个降幅达1.0log以上,低温和中温厌氧发酵中分别仅有4个和5个ARGs丰度降低。低温和中温厌氧发酵过程中ARGs和微生物群落变化相似,均与高温处理差异较大。此外,高温厌氧发酵可杀灭潜在致病菌,但其他处理中仍有残留。微生物群落演替是造成不同温度厌氧发酵过程中ARGs和整合子基因差异的主要原因。高温厌氧发酵通过降低携带ARGs的嗜常温细菌(Bacteroidetes和Proteobacteria)丰度从而降低ARGs丰度。厌氧发酵可通过降低整合子基因好氧宿主菌(Actinomycetales和Bacilli)的丰度以达到降低整合子基因的效果。综合考虑,高温厌氧发酵可被用以处理畜禽粪便以降低发酵产物环境风险。(2)与液态厌氧发酵相比,固态厌氧发酵对ARGs和MGEs有更好的去除效果。尤其是中温固态厌氧发酵,显著降低了牛粪中5/10个ARGs和4个MGEs丰度,降幅分别为0.47 0.86 log和0.16 1.03 logs。中温固态厌氧发酵处理对ARGs去除效果最佳,主要是由于其中与ARGs和MGEs呈显著正相关关系的Clostridium XII丰度较低,且与ARGs呈极显著负相关的Sphaerochaeta和Petrimonas丰度较高。与液态厌氧发酵不同,高温固态厌氧发酵未表现出对ARGs和MGEs有更高去除率。整合子基因和ISCR1对固态厌氧发酵过程中ARGs的水平转移发挥了重要作用。ARGs和MGEs的潜在宿主菌中62.5%属于Firmicutes,且不同TS厌氧发酵处理中ARGs的差异主要由微生物群落差异造成。(3)恩诺沙星的添加使厌氧发酵过程中sul1、aac(6')-ib-cr和int I2的相对丰度显著升高,且使发酵产物中int I1的相对丰度升高了0.86 0.90 log。这可能是由于恩诺沙星的添加对微生物形成选择性压力,从而提高了整合子和ARGs丰度。恩诺沙星对微生物群落的影响从第15天开始显现,主要表现为恩诺沙星处理中与ARGs呈极显著正相关关系的Methanosarcina丰度显著高于CK处理。至发酵结束时,恩诺沙星对微生物群落的影响消失。ARGs图谱的变化主要受微生物群落演替、pH和NO_3~--N的影响。ARGs与整合子的潜在宿主菌主要属于Firmicutes、Actinobacteria和Euryarchaeota,int I1对添加恩诺沙星牛粪厌氧发酵过程中ARGs的水平转移起重要作用。(4)由于阿散酸具有促生长和控制疾病的作用,猪粪中通常残留高浓度阿散酸,因此本文比较了3个浓度阿散酸(0、325和650 mg/kg干猪粪)对厌氧发酵过程中ARGs和微生物群落的影响。高浓度阿散酸的添加使发酵产物中tet C、sul2、erm B和gyrA的丰度升高了2倍以上。冗余分析表明微生物群落结构的变化是导致ARGs图谱变化的主要驱动因素。Network分析表明ARGs的大部分宿主菌属Firmicutes和Proteobacteria,重金属砷抗性基因arsC与4个ARGs和int I1共存,可能是导致高浓度阿散酸条件下ARGs丰度升高的原因。高浓度阿散酸会增加厌氧发酵产物中ARGs的环境风险,因此阿散酸作为饲料添加剂的使用应受到监管与控制。(5)20 g/L生物炭的添加降低了发酵产物中tet W、tet X、sul2、qnrA、qnrS、aac(6')-ib-cr、erm X和总ARGs的相对丰度,且使发酵过程中ISC R1丰度低于CK处理。5 g/L生物炭的添加降低了发酵产物中5/13 ARGs的相对丰度。生物炭的添加对厌氧发酵过程微生物群落产生了一定影响,20 g/L生物炭影响大于5 g/L处理。ARGs潜在宿主菌主要为Firmicutes,且生物炭主要通过影响Firmicutes和Proteobacteria丰度对ARGs图谱产生影响。ARGs图谱的次要影响因素为MGEs,其中int I2对添加生物炭厌氧发酵系统ARGs的传播扩散起重要作用,其次为ISCR1。综上所述,高温液态厌氧发酵通过降低中温宿主菌丰度从而降低ARGs丰度,高固体含量更有利于MGEs的削减,20 g/L生物炭的添加有利于厌氧发酵产物中四环素类和喹诺酮类ARGs丰度的降低。恩诺沙星和重金属As通过对微生物形成选择性压力,提高发酵产物ARGs丰度,因此应加强恩诺沙星和阿散酸在畜禽养殖业使用量的监管。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S859.796;X713

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